發(fā)育毒性研究中動物胚胎肢芽培養(yǎng)技術的運用,發(fā)育生物學論文

發(fā)育毒性研究中動物胚胎肢芽培養(yǎng)技術的運用,發(fā)育生物學論文隨著當代科學技術和工業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展以及生活水平的提高，人類所面臨的各種有害化學物質與新合成的化學物質、居室內(nèi)外的空氣污染物及一些生物、物理因素等對人體有害的因子越來越多。因而檢測相關因子對生物個體潛在的遺傳毒性及胚胎發(fā)育毒性的技術和方式方法也日益豐富。由于醫(yī)學實驗動物的胚胎發(fā)育時期比成年動物對環(huán)境中有害因素的影響更敏感，故常以檢測胚胎發(fā)育毒性作為評價和篩檢外源性化學、生物等因素的主要方式方法之一，同時可以討論其致畸作用機理、染毒劑量、時間及胚齡與致畸效應之間的量效關系和時效關系等，為各類物質的發(fā)育毒性提供安全性評價根據(jù)。動物胚胎的器官構成期是由胚胎細胞快速分裂、增殖、分化、運動、聚合并構成組織器官原形的經(jīng)過，假如進行體外器官培養(yǎng)則能避免母體內(nèi)多種因素的干擾，且能保持其體內(nèi)所具有的細胞間互相作用及形態(tài)特征和功能，它所經(jīng)歷的器官發(fā)生階段與體內(nèi)表現(xiàn)有一致性，所以生殖毒理及胚胎發(fā)育毒理的研究大多采用大鼠與小鼠鼠胚、雞胚、兔胚、斑馬魚胚等多種實驗動物胚胎材料進行體外全胚胎培養(yǎng)技術、或體外胚胎器官培養(yǎng)技術〔如胚胎肢芽、上頜發(fā)育等〕以及胚胎原代細胞培養(yǎng)技術〔如肢芽細胞、中腦細胞、海馬細胞、心肌細胞、成纖維細胞〕等，但是當下最常用仍為大鼠與小鼠的胚胎肢芽培養(yǎng)模型[1],由于此試驗方式方法中所選擇的胚胎肢芽細胞正處于分化前期，所以只要對動物胚胎增殖分化有毒性作用的外來化合物，都有可能抑制胚胎肢芽的構成及軟骨的發(fā)生。因而，肢芽器官及肢芽細胞培養(yǎng)技術，既能夠作為化學致畸物的安全評價系統(tǒng)，又可應用于胚胎發(fā)育毒性機理的研究。本文就近15年來我們國家肢芽器官與肢芽細胞體外培養(yǎng)技術的應用及進展作一綜述。1動物胚胎肢芽體外培養(yǎng)常用的技術當下動物肢芽體外培養(yǎng)實驗方式方法大多項選擇擇以小鼠、大鼠胚胎的肢芽為體外培養(yǎng)材料，常采用兩種的技術方式方法:第一，以肢芽整體器官在體外培養(yǎng)為主的試驗方式方法，稱肢芽器官培養(yǎng)法。是指應用顯微解剖技術從動物體內(nèi)分離出整體肢芽器官，在體外實驗室里盡可能模擬體內(nèi)的生存條件進行培養(yǎng)，使其生存、繼續(xù)生長、正常發(fā)育，并保持其有正常的構造與功能，以便在可控條件下進行形態(tài)學、組織學等多方面的實驗研究。如對培養(yǎng)后的大鼠或小鼠肢芽進行阿利新藍染色，可觀察其軟骨的發(fā)育并對其發(fā)育狀態(tài)給予評價〔如Neubert評分〕[2],或肢芽整體包埋切片后觀察肢芽軟骨發(fā)育的形態(tài)學變化，或應用免疫組化、原位雜交等方式方法檢測各種與發(fā)育相關基因、蛋白的表示出，以分析其影響發(fā)育的機制。此方式方法的特點是能具體表現(xiàn)出肢芽的整體發(fā)育狀況，并可與體內(nèi)相當發(fā)育時期的肢芽作比照分析，以討論體外培養(yǎng)時檢測某單一因素對胚胎的發(fā)育毒性。第二，以胚胎肢芽制備原代肢芽細胞懸液在體外培養(yǎng)為主方式方法，稱肢芽細胞培養(yǎng)法。此方式方法可使肢芽中未分化的間充質細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，對細胞增殖的影響進行檢測，或者肢芽細胞經(jīng)培養(yǎng)后能夠互相的辨別、移動、粘附著后聚集在一起，對構成分化后的軟骨細胞集落進行觀察。此項技術最早由Flint等在80年代建立的，后來Renault等又加以改良成微團培養(yǎng)法，一般采用正在分化的嚙齒類及鳥類的胚胎原代肢芽細胞體外培養(yǎng)模型，模擬體內(nèi)發(fā)育經(jīng)過，研究細胞間通訊、細胞和胞外基質的互相作用，用于分析各種暴露因子的生殖與發(fā)育毒性[3,4],在我們國家開展此項技術始自上世紀80年代初期，至90年代中期開場廣泛用于發(fā)育毒性物質的檢測中。并發(fā)現(xiàn)一些化學致畸物大多也都是細胞分化抑制劑，能使微團培養(yǎng)物中的細胞集落構成數(shù)明顯減少，通過細胞集落數(shù)的變化研究化學物對肢芽軟骨發(fā)生的作用，判定其發(fā)育毒性。2肢芽培養(yǎng)技術在發(fā)育毒理學中的研究與應用2.1有毒化學物質及環(huán)境污染物對肢芽細胞增殖分化的影響近年來人們針對室內(nèi)的環(huán)境污染日益擔憂，如甲醛、二甲苯、氟等多種有毒物質的污染對于人類發(fā)育中的嬰兒、幼兒及胚胎均有著不同程度的遺傳毒性及胚胎發(fā)育毒性。有學者選用小鼠肢芽體外培養(yǎng)方式方法分別研究了甲醛、苯、氟化物及乙醛的發(fā)育毒性，結果發(fā)現(xiàn)均可抑制小鼠胚胎肢芽的發(fā)育和分化，證實是潛在的致畸物。如吳成秋、李梓民等發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)液中苯的染毒濃度的增加，培養(yǎng)的小鼠胚胎肢芽軟骨細胞的集落數(shù)會逐步減少，肢芽細胞增殖遭到抑制，兩者均呈現(xiàn)較強的劑量-效應關系[5-8].張全新、屈衛(wèi)東等則均選用了大鼠胚胎肢芽細胞體外培養(yǎng)，也證實甲醛、甲苯、二甲苯這三種污染室內(nèi)生活空氣的主要物質具有上述研究的類似作用，且聯(lián)合染毒后毒性有相加作用[9];屈衛(wèi)東也證實了乙醛具有發(fā)育毒性作用和潛在的致畸作用[10].丙烯睛〔ACN〕、雙酚A〔BPA〕、等均為重要的有機化工原料，且有著不同程度的毒性，在其工業(yè)生產(chǎn)、加工運輸、儲藏銷售等多種環(huán)節(jié)均與人類有著密切的接觸。對這些化學有機物質的各類毒性研究范圍也在不斷拓展。如端禮榮等用大鼠胚胎肢芽細胞培養(yǎng)技術研究發(fā)現(xiàn)丙烯睛能抑制胚胎肢芽細胞增殖和分化，并經(jīng)其它檢測指標分析，丙烯晴抑制了肢芽細胞蛋白質合成、引起脂質過氧化而產(chǎn)生了細胞毒性[11].曾懷才等用小鼠胚胎肢芽細胞通過彗星實驗檢測了環(huán)境污染物氯化三丁基錫〔TBTCI〕證實其具有遺傳毒性[12].李勇、龍鼎新等采用大鼠肢芽細胞微團培養(yǎng)技術檢測了工業(yè)污染物雙酚A、對-壬基酚，證實均具有抑制肢芽細胞增殖作用，屬于陽性致畸物[13,14].2.2微量元素對肢芽細胞增殖分化的影響通過肢芽培養(yǎng)技術能夠檢測微量元素對肢芽細胞增殖與分化的影響。如硒、鋅等微量元素均是機體必需的，但研究證實機體內(nèi)微量元素含量太多或過少均會影響胚胎發(fā)育，并表現(xiàn)出不同程度的胚胎發(fā)育毒性。如國內(nèi)張全新等采用大鼠胚胎肢芽細胞培養(yǎng)技術研究發(fā)現(xiàn):亞硒酸鈉在較低的適當劑量有明顯的保衛(wèi)作用，包括抑制畸胎發(fā)生。過量就會產(chǎn)生明顯的細胞毒性和細胞分化抑制作用，但由于實驗結果為IP50小于ID50,所以分析過量導致的肢芽細胞分化抑制是一種細胞毒性物質，具有胚胎發(fā)育毒性，而不是致畸物，為硒的安全使用和揭示硒的發(fā)育毒性提供根據(jù)[15].李小玲等通過給小鼠胚胎肢芽細胞體外培養(yǎng)液中參加不同劑量的硫酸鋅，的發(fā)現(xiàn)微量元素鋅對小鼠胚胎肢芽細胞的分化和增殖表現(xiàn)為促進和抑制雙重作用，缺鋅及過量鋅均可抑制細胞的分化并產(chǎn)生毒性作用[16].郭衛(wèi)珍也通過小鼠肢芽細胞培養(yǎng)證實當鋅濃度達43.0~86.0mol/L時，對胚胎肢芽發(fā)育具有明顯的促進作用，而鋅缺乏〔0.0mol/L〕時或鋅過量〔172.0~215mol/L〕以上時均可以抑制小鼠胚胎肢芽的發(fā)育和分化[17].許遜等選則大鼠胚胎肢芽細胞培養(yǎng)，參加不同濃度的醋酸鋅，得出研究結果與上述類似，即對胚胎肢芽細胞增殖