生物分離工程細(xì)胞破碎

生物分離工程細(xì)胞破碎第1頁/共85頁學(xué)習(xí)目的和要求掌握解細(xì)胞分離和目標(biāo)產(chǎn)物的釋放的原理和方法，熟知各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用范圍。

第2頁/共85頁目錄一、細(xì)胞分離（一）、重力沉降（二）、離心沉降（三）、過濾二、細(xì)胞破碎與胞內(nèi)物釋放第3頁/共85頁細(xì)胞分離－學(xué)習(xí)要點(diǎn)識(shí)記：重力沉降、離心沉降和過濾的概念。理解：重力沉降、離心分離與過濾原理、理論；掌握Stokes（斯托克斯）沉降公式

。應(yīng)用：常用離心方法及優(yōu)缺點(diǎn)；利用掌握的提高分離效率的方法分析決實(shí)際問題

第4頁/共85頁（一）、重力沉淀1、重力沉淀的定義2、重力沉淀的理論3、提高重力沉降的途徑第5頁/共85頁1、重力沉降定義

重力沉降是傳統(tǒng)化工過程中常用的從含有固體顆粒的流體中將顆粒分離出來的操作。

重力沉降是利用流體與顆粒間的密度差，在重力的作用下使顆粒與流體之間產(chǎn)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)兩者的分離。

在生物分離過程中，定義中顆粒為細(xì)胞、細(xì)胞碎片等有形物第6頁/共85頁千姿百態(tài)的微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture第7頁/共85頁2、重力沉降理論理論假設(shè)細(xì)胞或細(xì)胞碎片按照球形顆粒處理；顆粒在無限稀釋的溶液中進(jìn)行沉降，顆粒之間無相互干擾

受力分析

球形顆粒重力fg液體的浮力fb顆粒運(yùn)動(dòng)方向相反的阻力

fs第8頁/共85頁FbFg

Fsd=2R球形顆粒沉降的受力情況第9頁/共85頁重力沉降理論重力：浮力：阻力：d,Ps—分別指顆粒的直徑（m）和密度（kg.m-3）第10頁/共85頁第11頁/共85頁重力沉降理論當(dāng)球形顆粒自身的重力與其所受到浮力和阻力達(dá)到平衡時(shí)，

則第12頁/共85頁重力沉降理論當(dāng)球形顆粒處于滯流區(qū)（）時(shí)

Stokes公式當(dāng)球形顆粒處于過渡區(qū)（）時(shí)

Allen公式當(dāng)球形顆粒處于湍流區(qū)（）時(shí)Newton公式第13頁/共85頁千姿百態(tài)的微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture球形顆粒？無限稀釋溶液？第14頁/共85頁3、提高重力沉降的途徑加入中性鹽：雙電層排斥電位降低加入高分子絮凝劑：架橋作用形成大絮凝圖引入外力第15頁/共85頁（二）、離心沉淀1、離心沉淀的定義2、離心沉淀的理論3、離心分離方法4、離心分離設(shè)備第16頁/共85頁1、離心沉降定義離心沉降是利用沉降設(shè)備使流體和顆粒旋轉(zhuǎn)，在離心力的作用下，由于顆粒和流體間存在密度差，所以顆粒沿徑向與流體產(chǎn)生相對(duì)運(yùn)動(dòng)，從而使顆粒和流體分離。第17頁/共85頁第18頁/共85頁第19頁/共85頁2、離心沉降理論離心沉降速度

令：第20頁/共85頁3、離心分離方法差速離心分級(jí)區(qū)帶離心差速區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心第21頁/共85頁差速離心分離差速離心是以菌體細(xì)胞的收集或除去為目的的固液離心分離方法，應(yīng)用某一特定顆粒沉淀的離心力在預(yù)定的離心時(shí)間內(nèi)得到一部分顆粒沉淀及包含未沉淀顆粒的上清液。第22頁/共85頁差速離心分離應(yīng)用實(shí)例600g10min15000g10min100000g60min300000g120minnucleiMitochondrialysosomesPlasmamembraneRiosomalsubunitshomogenateFilteredhomogenateSolublepartofcytoplasmSedimentation第23頁/共85頁區(qū)帶離心分離－前提

在離心管內(nèi)的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同濃度（密度）的梯度介質(zhì)（蔗糖等），按照濃度從大到小的原則，依次層層加入。加入離心管中的梯度介質(zhì)經(jīng)高速離心或靜置后可形成連續(xù)的密度梯度。第24頁/共85頁操作過程第25頁/共85頁區(qū)帶離心種類差速區(qū)帶離心(速度區(qū)帶離心）平衡區(qū)帶離心（等密度離心）第26頁/共85頁差

速

區(qū)

帶

離

心第27頁/共85頁差速區(qū)帶離心基于顆粒的大小、形狀的分離梯度液的最大密度不能超過所分離顆粒的最大密度離心過程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等動(dòng)態(tài)離心分離方法第28頁/共85頁平衡區(qū)帶離心第29頁/共85頁平衡區(qū)帶離心梯度液密度范圍含蓋全部待分離顆粒密度離心過程中，顆粒不斷沉降至其浮力密度與梯度液密度相等平衡離心分離方法第30頁/共85頁梯度液的種類和應(yīng)用第31頁/共85頁細(xì)胞分離－區(qū)帶離心異同區(qū)帶離心種類差速區(qū)帶離心平衡區(qū)帶離心共同點(diǎn)事先在離心管內(nèi)用低分子量溶質(zhì)調(diào)配好密度梯度梯度介質(zhì)常用蔗糖常用氯化銫密度梯度最大的密度梯度低于最大密度的沉降樣品最大的密度梯度大于最大密度的沉降樣品區(qū)帶形成條件根據(jù)各個(gè)組分沉降系數(shù)的差別，形成各自的區(qū)帶根據(jù)各組分密度差形成區(qū)帶離心條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時(shí)間，低速度使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時(shí)間，高速度

第32頁/共85頁離心方法新進(jìn)展具體表現(xiàn)在哪幾個(gè)方面？1.固定角轉(zhuǎn)子垂直管離心法的進(jìn)展使用垂直管轉(zhuǎn)子的成功之例是1980年由B.H.Chung等提高的血清脂蛋r白分離的SVs方法(即SingleVerticalSpin法,一單次垂直管離心法)，它使對(duì)臨床診斷意義很大的這一分離在實(shí)用上成為可能.傳統(tǒng)的血清脂蛋白分離用“順序浮選法”(即SF法)，一次分離需時(shí)3天，用去驅(qū)動(dòng)壽命1億轉(zhuǎn)以上。現(xiàn)用垂直管轉(zhuǎn)子作SVS方法，不連續(xù)NaCI/KBr或NaCI/Sucrose梯度，5.5萬一6.5萬轉(zhuǎn)/分，0.75-2.5i)時(shí)，一次分離成功。第33頁/共85頁3.短液柱離心法(Short-Columnmethod)由美國的0.M.Griffith在1978年提出。短柱法是在角式或水平轉(zhuǎn)子中人為地使用不加滿的離心管來降低液柱高。此法不僅降低液柱高以減少離心時(shí)間，更重要的是使處千液面的樣品受到更大的離心力從而進(jìn)一步縮短了離心時(shí)間，在不減少樣品量和樣品濃度的條件下，可把離心時(shí)間縮短為常規(guī)滿管離心時(shí)的一半或更少。短液柱法使用中厚PC管和厚壁PA管，它們?cè)诓患訚M離心時(shí)也不會(huì)變形。第34頁/共85頁4.細(xì)絕(或細(xì)菌)的離心洗脫(Flutriator)技術(shù)這是美國Beckman公司近年發(fā)展的一種低速連續(xù)洗脫技術(shù)，特別適用于培養(yǎng)液的連續(xù)收集。使用的是帶小容量連續(xù)離心池的JE-6B轉(zhuǎn)子.其洗脫原理不是在一般轉(zhuǎn)子中的沉降，而是被分離物在離心中的“浮選”。用4.2ml的離心池可在1小時(shí)內(nèi)從100-1000m!的原液中回收10'-10，個(gè)細(xì)胞。第35頁/共85頁2.超速連續(xù)離心法超速連續(xù)離心轉(zhuǎn)子是由美國Beckman公司開發(fā)的，最適用于病毒的純化，從大量的組織勻漿中分離亞細(xì)胞組織、培養(yǎng)液中細(xì)菌的收集，以及污水研究。第36頁/共85頁4、離心設(shè)備分類分類方法名稱處理量實(shí)驗(yàn)室用離心機(jī)，工業(yè)用離心機(jī)溫度常溫離心機(jī)、冷凍離心機(jī)轉(zhuǎn)速低速離心機(jī)、高速離心機(jī)、超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子結(jié)構(gòu)管式、碟式第37頁/共85頁常用離心設(shè)備Solids-ejectingdiskbowlcentrifugeofpilotsizeforsterilizablecontainedinstallation

Nozzlemachinewithpressurizedsolidsdischargeforyeastandbacteriaseparation

第38頁/共85頁常用離心設(shè)備Decantercentrifuge

Multichamberbowl,verticalcut

第39頁/共85頁管式離心設(shè)備AdisposablecellseparationinsertPowerfugeTMone-chamberwithscraper第40頁/共85頁Tubularbowl第41頁/共85頁碟片離心設(shè)備(a)Solids-retainingdiskbowl,(b)Radialsolids-ejectingdiskbowl,topfeed.(c)Radialsolids-ejectingdiskbowl,hermeticfeed.(d)Axialsolids-ejectingdiskbowl.(e)Nozzlebowlwithpressurizedsolidsdischarge.(f)Nozzlebowlwithperipheraldischargenozzles.第42頁/共85頁第43頁/共85頁離心設(shè)備比較管式離心機(jī)優(yōu)點(diǎn)結(jié)構(gòu)簡單，轉(zhuǎn)速和離心力較大缺點(diǎn)沉降面積小、處理能力低；碟式離心機(jī)優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)子中存在隔板以增大沉降面積，處理能力大缺點(diǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、轉(zhuǎn)速較低；第44頁/共85頁離心機(jī)處理能力粒子在徑向上的沉降速度

軸向移動(dòng)速度

完全沉降的邊界條件

第45頁/共85頁離心機(jī)處理能力影響因素

處理樣品的特性，如密度、粒徑等溶液的特性，如密度、粘度等離心機(jī)機(jī)械結(jié)構(gòu)，如r1和r2操作條件，ω

第46頁/共85頁（三）、過濾1、過濾的定義2、過濾的受力分析3、提高過濾速度的途徑第47頁/共85頁1、過濾定義過濾是利用多孔性介質(zhì)（如濾布）截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液分離的方法。

過濾本身是一種膜分離技術(shù)。在分離細(xì)胞、菌體或它們的碎片過程中除了沉降分離方法外，過濾技術(shù)也是一種常備的分離方法。第48頁/共85頁2、過濾過程受力分析推動(dòng)力：過濾操作以壓力差為主要推動(dòng)力；

阻力：過濾過程的阻力來自多孔性過濾介質(zhì)和介質(zhì)表面不斷堆積形成的濾餅

第49頁/共85頁過濾速率Q：液體的流量A:面積Rm表示介質(zhì)的阻力；Rc表示濾餅的阻力；μL為濾液的粘度第50頁/共85頁恒壓過濾方程Ruth恒壓過濾方程其中，K為Ruth恒壓過濾系數(shù)，表示為第51頁/共85頁3、提高過濾速度的途徑采用絮凝或凝聚的方法預(yù)處理改變料液的性質(zhì)，降低濾餅阻力加入助濾劑以改變?yōu)V餅的壓縮性指數(shù)，提高過濾速度第52頁/共85頁

濾餅傳統(tǒng)的過濾cakeConventionalfiltration第53頁/共85頁第54頁/共85頁第55頁/共85頁第56頁/共85頁第57頁/共85頁二、細(xì)胞破碎與胞內(nèi)物釋放1、概述2、細(xì)胞破碎技術(shù)的分類3、常用破碎方法的介紹第58頁/共85頁－學(xué)習(xí)要點(diǎn)理解：各種細(xì)胞破碎方法原理、優(yōu)缺點(diǎn)及其適用范圍。應(yīng)用：采用不同的細(xì)胞破碎方法對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行不同程度的破碎。第59頁/共85頁1、概述（1）細(xì)胞結(jié)構(gòu)（2）細(xì)胞膜的組成（3）影響產(chǎn)物釋放的因素第60頁/共85頁（1）細(xì)胞結(jié)構(gòu)

（真核細(xì)胞與原核細(xì)胞）動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，只有由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的細(xì)胞膜植物細(xì)胞細(xì)胞膜外有一層堅(jiān)固的細(xì)胞壁酵母細(xì)胞細(xì)胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，更加難以破碎真核細(xì)胞原核細(xì)胞革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁由肽聚糖層組成，壁厚約15～50nm，肽聚糖含量為40~90%，細(xì)胞壁較革蘭氏陰性菌堅(jiān)固。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁在肽聚糖的外側(cè)還有分別由（1）脂蛋白和（2）磷脂和脂多糖構(gòu)成的兩層外壁層，外壁層厚度越8～10nm。第61頁/共85頁（2）細(xì)胞膜組成（A）（B）第62頁/共85頁（3）影響產(chǎn)物釋放的環(huán)境因素在復(fù)雜培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細(xì)胞其破碎較單一培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌細(xì)胞更難；對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)得更加脆弱。從連續(xù)培養(yǎng)過程中獲得的、具有較高比生長速率的念珠菌的細(xì)胞壁更加脆弱，而搖瓶培養(yǎng)的念珠菌體則有更加充裕的機(jī)會(huì)構(gòu)建更加堅(jiān)固的細(xì)胞壁。酵母細(xì)胞壁的厚度和破碎阻力隨年齡增長而增加經(jīng)常在幼酵母細(xì)胞中出現(xiàn)的芽痕（Budscars）可引起酵母細(xì)胞局部細(xì)胞壁強(qiáng)度的降低第63頁/共85頁2、細(xì)胞破碎技術(shù)的分類細(xì)胞破碎的目的是釋放出細(xì)胞內(nèi)含物，其方法很多，按照是否存在外加作用力可分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。第64頁/共85頁細(xì)胞破碎技術(shù)分類細(xì)胞破碎機(jī)械破碎高壓均漿法，珠磨法、撞擊破碎、超聲波破碎非機(jī)械破碎物理法滲透壓沖擊、凍結(jié)-融化、（超聲波）化學(xué)法酸堿處理、化學(xué)試劑處理生物法酶溶、自溶、噬菌體第65頁/共85頁第66頁/共85頁3、常用細(xì)胞破碎方法介紹第67頁/共85頁

（1）機(jī)械破碎－高壓勻漿細(xì)胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥桿之間的環(huán)隙高速（可達(dá)到450m/s）噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。

第68頁/共85頁缺點(diǎn)：這種方法較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽性首以及有些亞細(xì)胞器，質(zhì)地堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥，也不適合用該法處理。第69頁/共85頁（2）機(jī)械破碎－－珠磨珠磨機(jī)的破碎室內(nèi)填充有80～85％（v/v）的玻璃（密度為2.5g/ml）或氧化鋯（密度為6.0g/ml）的微球（粒徑約0.1~1.0mm）。在攪拌槳的高速攪拌下微球高速運(yùn)動(dòng)，微球與微球之間以及微球和細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。第70頁/共85頁缺點(diǎn)：設(shè)備是珠后機(jī)，在珠波分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，破碎中，生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。存在的問題：操作參數(shù)多，一般憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)并且珠子之間的液體損失30％左右。第71頁/共85頁（3）機(jī)械破碎－－撞擊破碎撞擊破碎原理：細(xì)胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)（凍結(jié)速度為數(shù)千℃/min），形成粒徑小于50微米的微粒子，高速載氣（如氮?dú)猓魉贋?00m/s）將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。第72頁/共85頁

（4）機(jī)械破碎－－超聲波破碎壓電傳感器將電子振蕩器的交變電流轉(zhuǎn)換為聲波。在超聲波的作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。第73頁/共85頁第74頁/共85頁缺點(diǎn)：超聲波破碎在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時(shí)操作簡便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難。第75頁/共85頁－非機(jī)械破碎之酸堿處理化學(xué)試劑處理酶溶自溶滲透壓沖擊法凍結(jié)-融化法第76頁/共85頁（5）化學(xué)滲透法有些有機(jī)溶劑(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性劑、金