熒光光譜原理和應(yīng)用

熒光光譜原理和應(yīng)用第1頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光（通常是紫外線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光（通常波長(zhǎng)在可見(jiàn)光波段）；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱(chēng)之為熒光。

2第2頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二磷光是一種緩慢發(fā)光的光致冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光（通常是紫外線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)（具有和基態(tài)不同的自旋多重度），然后緩慢地退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光，而且與熒光過(guò)程不同，當(dāng)入射光停止后，發(fā)光現(xiàn)象持續(xù)存在。發(fā)出磷光的退激發(fā)過(guò)程是被量子力學(xué)的躍遷選擇規(guī)則禁戒的，因此這個(gè)過(guò)程很緩慢。3第3頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4第4頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二5第5頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二主要內(nèi)容熒光光譜的基本原理1熒光光譜儀的原理、操作及數(shù)據(jù)處理2熒光光譜的應(yīng)用3參考資料46第6頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光光譜的基本原理7第7頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜；在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)；一、分子能級(jí)與躍遷激發(fā)：

基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；失活：

激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見(jiàn)能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)

S1、S2…

；第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)

T1、T2…

；8第8頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

電子激發(fā)態(tài)的多重度：

M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；電子激發(fā)態(tài)的多重度單重態(tài)：一個(gè)分子中所有電子自旋都配對(duì)的電子狀態(tài)。三重態(tài)：有兩個(gè)電子的自旋不配對(duì)而平行的狀態(tài)。激發(fā)三重態(tài)能量較激發(fā)單重態(tài)低。9第9頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二10第10頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二躍遷規(guī)則躍遷前后原子核的構(gòu)型沒(méi)有發(fā)生改變、躍遷過(guò)程中電子自旋沒(méi)有改變、躍遷前后電子的軌道在空間有較大的重疊和軌道的對(duì)映性發(fā)生了改變的躍遷是允許的；（S0→S1允許躍遷）躍遷過(guò)程中電子自旋發(fā)生了改變、躍遷前后電子的軌道在空間不重疊或軌道的對(duì)映性未發(fā)生改變的躍遷是禁阻的。（S0→T1禁阻躍遷）Franck-Condon原理：在電子躍遷完成的瞬間，分子中原子核的構(gòu)型是來(lái)不及改變的。11第11頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二單重態(tài)能級(jí)間的躍遷符合光譜選律，躍遷概率大。分子通過(guò)吸收輻射而直接被激發(fā)到三重態(tài)的躍遷是禁阻的，概率很小。12第12頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二雅布隆斯基分子能級(jí)圖S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫S

213第13頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，容易返回基態(tài)，在這個(gè)過(guò)程中通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量，這個(gè)過(guò)程就稱(chēng)為失活。失活途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間竄越振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷

激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大。失活的途徑14第14頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間一般為10-12s。激發(fā)態(tài)分子常常首先發(fā)生振動(dòng)馳豫。

無(wú)輻射躍遷失活的途徑通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：多重度相同的電子能級(jí)中等能級(jí)間的無(wú)輻射能級(jí)躍遷。15第15頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二無(wú)輻射躍遷失活的途徑系間竄越：不同多重態(tài)，有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。

改變電子自旋，禁阻躍遷，通過(guò)自旋—軌道耦合進(jìn)行。含有重原子的分子中（如I、Br等），系間竄躍最常見(jiàn)。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；

外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。16第16頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（多為S1→S0躍遷），發(fā)射波長(zhǎng)為’2的熒光；10-7～10-9s。輻射躍遷失活的途徑磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（多為T(mén)1→S0躍遷）；發(fā)射波長(zhǎng)為3的磷光；

10-4～100s。電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)換→系間竄越→振動(dòng)弛豫→T1

發(fā)光速度很慢，光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。

磷光僅在很低的溫度或黏性介質(zhì)中才能觀測(cè)到，因此磷光很少應(yīng)用于分析由圖可見(jiàn)，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長(zhǎng)長(zhǎng)；’2>2>1；17第17頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光產(chǎn)生的過(guò)程：（1）處于基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的熒光物質(zhì)分子受到紫外線的照射，吸收了和它所具有的特征頻率相一致的光線，躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)；（2）被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)的分子通過(guò)無(wú)輻射躍遷降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)；（3）降落到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的分子繼續(xù)降落到基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)，同時(shí)發(fā)射出相應(yīng)的光量子，這就是熒光：（4）到達(dá)基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)的分子再通過(guò)無(wú)輻射躍遷最后回到基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)．18第18頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線，如右圖中曲線II。熒光本身則是由電子在兩能級(jí)間不發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過(guò)程中所產(chǎn)生的光。磷光光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)物質(zhì)發(fā)射的磷光強(qiáng)度與發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線，如右圖中曲線III。磷光本身則是由電子在兩能級(jí)間發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過(guò)程中所產(chǎn)生的光。熒光光譜與磷光光譜19第19頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二光譜圖20第20頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二激發(fā)光譜

固定發(fā)射波長(zhǎng)(一般將其固定于發(fā)射波段中感興趣的峰位)，掃描出的化合物的發(fā)射光強(qiáng)度(熒光/磷光)與入射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。

二、主要光譜參量發(fā)射光譜

固定激發(fā)波長(zhǎng)(一般將其固定于激發(fā)波段中感興趣的峰位)，掃描出的化合物的發(fā)射光強(qiáng)度(熒光/磷光)與入射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。吸收光譜

化合物的吸收光強(qiáng)度與入射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線。21第21頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二主要光譜參量

吸收光譜反映出的是物質(zhì)的基態(tài)能級(jí)與激發(fā)態(tài)能級(jí)之間所有的允許躍遷。通常狀態(tài)下的物質(zhì)的表觀顏色大部分時(shí)候取決于其吸收特性。

激發(fā)光譜則反映的是基態(tài)與所有與該熒光發(fā)射有關(guān)的能級(jí)之間的躍遷。其所呈現(xiàn)的關(guān)系比吸收光譜要有選擇性，但有時(shí)候又不如吸收光譜來(lái)的直接。22第22頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

a.Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。熒光的波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光的波長(zhǎng)。這是由于發(fā)射熒光之前的振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換過(guò)程損失了一定的能量。

b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光(如‘2)。

c.

鏡像規(guī)則通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。23第23頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二產(chǎn)生斯托克位移的主要原因：1.躍遷到激發(fā)態(tài)高振動(dòng)能級(jí)的激發(fā)態(tài)分子，首先以更快的速率發(fā)生振動(dòng)弛豫（其速率在1013/s數(shù)量級(jí)），散失部分能量，達(dá)到零振動(dòng)能級(jí)，一般從零振動(dòng)能級(jí)發(fā)射熒光；2.激發(fā)態(tài)形成后，其分子的構(gòu)型將很快進(jìn)一步調(diào)整，以達(dá)到激發(fā)態(tài)的穩(wěn)定構(gòu)型，這又損失了部分能量；3.發(fā)射熒光的激發(fā)態(tài)多為（π，π*）態(tài)，這種激發(fā)態(tài)較基態(tài)時(shí)有更大的極性，因此將在更大程度上為極性溶劑所穩(wěn)定，使激發(fā)態(tài)的能量進(jìn)一步降低。斯托克位移24第24頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二關(guān)于激發(fā)光的波長(zhǎng)λ1：①?zèng)Q定熒光物質(zhì)是否能夠產(chǎn)生吸收并發(fā)射出熒光；②能夠使熒光物質(zhì)產(chǎn)生吸收并發(fā)射出熒光的激發(fā)光的波長(zhǎng)并不具有唯一性；③在保證激發(fā)的前提下，不同激發(fā)波長(zhǎng)處的熒光發(fā)射光譜相同，但熒光強(qiáng)度不同。④在進(jìn)行熒光測(cè)定時(shí)，須選擇激發(fā)光波長(zhǎng)以保證熒光強(qiáng)度最大。25第25頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光發(fā)射是光吸收的逆過(guò)程。熒光發(fā)射光譜與吸收光譜有類(lèi)似鏡影的關(guān)系。但當(dāng)激發(fā)態(tài)的構(gòu)型與基態(tài)的構(gòu)型相差很大時(shí)，熒光發(fā)射光譜將明顯不同于該化合物的吸收光譜。鏡像規(guī)則26第26頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二鏡像規(guī)則的解釋

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似；

基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的零振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

27第27頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二三、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。

28第28頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類(lèi)型：*→的熒光效率高，系間跨越過(guò)程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。29第29頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二化合物相對(duì)熒光強(qiáng)度熒光波長(zhǎng)/nm

C6H6（苯）10270~310

C6H5COOHC6H5NO230310~390

C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN1718202020270~320285~365285~345310~405280~360

C6H5ClC6H5BrC6H5I750275~345290~38030第30頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二

物質(zhì)分子發(fā)射熒光的能力用熒光量子產(chǎn)率（Φ）表示：Φ與失活過(guò)程的速率常數(shù)k有關(guān)：

凡是使熒光速率常數(shù)kf增大而使其他失活過(guò)程（系間竄越、外轉(zhuǎn)換、內(nèi)轉(zhuǎn)換）的速率常數(shù)減小的因素（環(huán)境因素和結(jié)構(gòu)因素）都可使熒光增強(qiáng)。2熒光量子產(chǎn)率Φ31第31頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二四、影響熒光強(qiáng)度的外部因素

1.溶劑的影響

溶劑極性增加，有時(shí)會(huì)使熒光強(qiáng)度增加，熒光波長(zhǎng)紅移。若溶劑和熒光物質(zhì)形成氫鍵或使熒光物質(zhì)電離狀態(tài)改變，會(huì)使熒光強(qiáng)度、熒光波長(zhǎng)改變。含重原子的溶劑（碘乙烷、四溴化碳）使熒光減弱，磷光增強(qiáng)。

溶劑粘度減小時(shí)，可以增加分子間碰撞機(jī)會(huì)，使無(wú)輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強(qiáng)度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對(duì)溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上升，熒光強(qiáng)度下降。32第32頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2.溫度的影響

熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在0℃以下，溫度每降低10℃，f增加3％，在80℃時(shí)，f為1。33第33頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二3pH值的影響

含有酸性或堿性取代基的芳香化合物的熒光與pH有關(guān)。pH的變化影響了熒光基團(tuán)的電荷狀態(tài)，從而使其熒光發(fā)生變化?；衔锵鄬?duì)熒光強(qiáng)度C6H5OH18C6H5O—

0C6H5NH2

20C6H5NH3

+034第34頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；35第35頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二5.熒光熄滅劑熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱(chēng)為熒光熄滅劑(quenchingmedium)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均為常見(jiàn)的熒光熄滅劑。36第36頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二6、散射光小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射。瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變。其波長(zhǎng)與入射光波長(zhǎng)相同。拉曼光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而發(fā)射出比入射光稍長(zhǎng)或稍短的光。散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾，尤其是波長(zhǎng)比入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的拉曼光，與熒光波長(zhǎng)接近，對(duì)測(cè)定的干擾大，必須采取措施消除。拉曼光的干擾主要來(lái)自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光與被測(cè)物質(zhì)的熒光光譜相重疊時(shí)，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)光波長(zhǎng)37第37頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二a:320nm或350nm為激發(fā)光，熒光峰總是在448nm。

b:將空白溶劑分別在320nm及350nm激發(fā)光照射下測(cè)定熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為320nm時(shí)，拉曼光波長(zhǎng)是360nm，360nm的拉曼光對(duì)熒光無(wú)影響；當(dāng)激發(fā)光波長(zhǎng)為350nm時(shí)，拉曼光波長(zhǎng)是400nm，400nm的拉曼光對(duì)熒光有干擾，因而影響測(cè)定結(jié)果。

硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光與散射光譜

38第38頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光光譜儀的原理、操作及數(shù)據(jù)處理39第39頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光光譜儀的基本原理特殊點(diǎn)：有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。40第40頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二光源：

高壓氙燈發(fā)出的光線強(qiáng)度大，而且是連續(xù)光譜，通用性較好，但氙弧燈熱效應(yīng)大，穩(wěn)定性較差，對(duì)電壓穩(wěn)定性要求較高。高功率連續(xù)可調(diào)激光光源是一種新型熒光激發(fā)光源。激光的單色性好、強(qiáng)度大。激光光源近年來(lái)應(yīng)用日益普遍。

41第41頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二單色器：第一單色器——選擇激發(fā)光波長(zhǎng)λ1

（＞250nm的紫外光），稱(chēng)為激發(fā)單色器。第二單色器——選擇(測(cè)量)發(fā)射光（熒光）波長(zhǎng)λ2，與激發(fā)光入射方向垂直，稱(chēng)為熒光單色器。樣品池：

采用低熒光材料，通常為四面透光的石英池。檢測(cè)器：

光電倍增管。42第42頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二液體樣品準(zhǔn)備1.溶液樣品盡量使用透明的玻璃化溶液，避免在這種匯聚式光路中由于比色皿中溶液的前后吸收不均導(dǎo)致的光譜失真問(wèn)題。2.為安全起見(jiàn)，對(duì)于使用揮發(fā)性劇毒溶劑的測(cè)試，一定要有合適的防護(hù)。3.易揮發(fā)、易變質(zhì)的溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)測(cè)。4.液體樣品一般放在帶蓋石英比色皿（與紫外測(cè)試所用比色皿不同，為側(cè)面全透明型）中進(jìn)行測(cè)試。43第43頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二測(cè)試準(zhǔn)備由于物質(zhì)的發(fā)射特性和吸收特性是緊密相關(guān)的，所以提前做好吸收譜可以有效縮短熒光測(cè)試的摸索時(shí)間。對(duì)于不知道相關(guān)特性的樣品，吸收譜的測(cè)試比熒光光譜的測(cè)試要容易很多。所以，建議大家先測(cè)一下樣品的吸收譜，并從中找出感興趣的吸收峰和特性，在熒光測(cè)試時(shí)以便參考。44第44頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二光譜測(cè)試開(kāi)機(jī)

電源——燈源2.熒光光譜

固定激發(fā)光的波長(zhǎng)，選擇合適的熒光光譜波長(zhǎng)范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等測(cè)量不同熒光波長(zhǎng)處熒光的強(qiáng)度，得到熒光光譜，即熒光強(qiáng)度—熒光波長(zhǎng)圖。

3.激發(fā)光譜

在熒光最強(qiáng)的波長(zhǎng)處固定熒光波長(zhǎng)，選擇合適的激發(fā)光譜波長(zhǎng)范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等測(cè)量隨激發(fā)光波長(zhǎng)的改變而變化的熒光強(qiáng)度，得到熒光激發(fā)光譜。即熒光強(qiáng)度-激發(fā)光波長(zhǎng)圖。45第45頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二4.熒光光譜

在熒光最強(qiáng)的波長(zhǎng)處固定激發(fā)波長(zhǎng)，選擇合適的熒光光譜波長(zhǎng)范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進(jìn)行發(fā)射譜的掃描。5.重復(fù)3、4步循環(huán)掃描得到理想的光譜圖。7.關(guān)機(jī)光源——電源6.保存數(shù)據(jù)光譜測(cè)試激發(fā)波長(zhǎng)一定要小于發(fā)射波長(zhǎng)。46第46頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二光路狹縫和掃描速度的選擇如果光路狹縫太大，熒光信號(hào)太強(qiáng)，容易超出儀器檢測(cè)范圍，損傷儀器；如果狹縫開(kāi)的太小，熒光信號(hào)又太弱，檢測(cè)比較困難，所以要選擇大小合適的狹縫。如果掃描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信號(hào)；掃描太慢則浪費(fèi)時(shí)間。所以只要能掃描得到平滑的光譜曲線就可以了。47第47頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光光譜的應(yīng)用48第48頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二1.定量依據(jù)與方法(1)定量依據(jù)

熒光強(qiáng)度

If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率：

If=Ia由朗伯-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：

If

=2.3I0lc

=Kc49第49頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二（2）定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法：

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣測(cè)定熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再在相同條件下測(cè)量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度；比較法：在線性范圍內(nèi)，測(cè)定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較；50第50頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二2、熒光光譜的應(yīng)用熒光探針金屬-有機(jī)配合物（MOF）發(fā)光材料分子傳感器物質(zhì)的檢測(cè)稀土摻雜發(fā)光材料發(fā)光器件光譜51第51頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二(1)無(wú)機(jī)化合物的分析

與有機(jī)試劑配合物后測(cè)量；可測(cè)量約60多種元素。鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法；氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測(cè)定；銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過(guò)氧化氫采用催化熒光法測(cè)定；鉻、鈮、鈾、碲采用低溫?zé)晒夥y(cè)定；鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測(cè)定(2)生物與有機(jī)化合物的分析見(jiàn)表52第52頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二53第53頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二54第54頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二與蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)構(gòu)非共價(jià)相互作用而使一種或幾種熒光性質(zhì)發(fā)生改變的小分子物質(zhì)?？捎糜谘芯看蠓肿游镔|(zhì)的性質(zhì)和行為。熒光探針目前常用的熒光探針有熒光素類(lèi)探針、無(wú)機(jī)離子熒光探針、熒光量子點(diǎn)、分子信標(biāo)等。熒光探針除應(yīng)用于核酸和蛋白質(zhì)的定量分析外，在核酸染色、DNA電泳、核酸分子雜交、定量PCR技術(shù)以及DNA測(cè)序上都有著廣泛的應(yīng)用。熒光探針：55第55頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月20日，星期二熒光探針過(guò)渡金屬配合物很多能實(shí)現(xiàn)較強(qiáng)的紅外波段寬帶發(fā)射，可以有效避開(kāi)組織體的吸收，可以穿透組織體實(shí)現(xiàn)紅外成像，克服同位素原子示蹤對(duì)人體的傷害；壽命處于μs量級(jí)，可以用于較大分子的形變和轉(zhuǎn)動(dòng)擴(kuò)散研究，當(dāng)然，結(jié)合其特有的發(fā)射波段也能對(duì)活體環(huán)境中的許多擴(kuò)散和轉(zhuǎn)變過(guò)程進(jìn)行研究。56第56頁(yè)，共60頁(yè)，2023年，2月2