第四章動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)

第四章動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)第1頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二一、培養(yǎng)基的基本要求

營(yíng)養(yǎng)成分促生長(zhǎng)因子激素滲透壓pH無毒、無污染第2頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二一、培養(yǎng)基的基本要求1、營(yíng)養(yǎng)成分

氨基酸：氨基酸是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所以細(xì)胞都需要12種必須氨基酸（纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、絡(luò)、精、胱）。此外還需要谷氨酰胺，他在細(xì)胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物質(zhì)。

單糖：培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。第3頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二維生素：主要是輔酶、輔基，必不可少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素、維生素B12都是培養(yǎng)基常有的成分。無機(jī)離子與微量元素：細(xì)胞生長(zhǎng)除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮、磷等基本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、銅、錳、鉬、釩等。

第4頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二2、促生長(zhǎng)因子及激素各種激素、生長(zhǎng)因子的功能

維持細(xì)胞的功能保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化）有些激素對(duì)許多細(xì)胞生長(zhǎng)有促生長(zhǎng)作用，如胰島素，它能促進(jìn)細(xì)胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素對(duì)某一類細(xì)胞有明顯促進(jìn)作用，如氫化可的松可促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，泌乳素有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)作用等。

第5頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二3、滲透壓細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg，可視為培養(yǎng)人體細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在320mOsm/kg左右。大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，滲透壓在260-320mOsm/kg的范圍都適宜。第6頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二4、pH大多數(shù)細(xì)胞適宜pH為7.2-7.4培養(yǎng)基應(yīng)具備一定的緩沖能力造成pH波動(dòng)主要是代謝產(chǎn)生的CO2，在封閉式培養(yǎng)過程中CO2與水結(jié)合產(chǎn)生碳酸，培養(yǎng)基pH很快下降。為解決這一問題，合成培養(yǎng)基中使用了NaHCO3-CO2緩沖系統(tǒng)，通過穩(wěn)定調(diào)節(jié)溫箱中CO2濃度（5%），使之與培養(yǎng)基中的NaHCO3處于平衡狀態(tài)。第7頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二5、無毒、無污染體外生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有任何抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)到：

無化學(xué)物質(zhì)污染無微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等）無對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體）對(duì)于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作。對(duì)于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應(yīng)十分潔凈，配制后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。第8頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二二、天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基：血清的種類血清的主要成分和作用血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)血清的外觀血清的使用與儲(chǔ)存使用血清的優(yōu)缺點(diǎn)第9頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二天然培養(yǎng)基：指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基。如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。但是由于天然培養(yǎng)基制作過程復(fù)雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。目前廣泛使用的培養(yǎng)基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細(xì)胞貼壁的膠原類物質(zhì)在培養(yǎng)某些特殊細(xì)胞液是必不可少的。第10頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二血清的種類：

小牛血清取自出生10-30天的小牛

新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生

胎牛血清取自剖腹產(chǎn)的胎牛，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對(duì)細(xì)胞有害的成分最少。第11頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二血清的主要成分和作用主要成分血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(zhǎng)因子、激素、無機(jī)物等。主要作用提供基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供激素和各種生長(zhǎng)因子提供結(jié)合蛋白對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞起到某些保護(hù)作用第12頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)量高低取決于兩方面因素：一是取材對(duì)象，二是取材過程。理化性質(zhì)：滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內(nèi)毒素等。蛋白含量包括血清總蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（應(yīng)小于20g/L）、血紅蛋白含量等。其中球蛋白含量是一項(xiàng)非常重要的指標(biāo)，血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質(zhì)量越高。血紅蛋白也是越低越好。

第13頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二微生物檢測(cè)包括細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對(duì)支原體、病毒的檢測(cè)。支原體是一種很小的微生物，可通過孔徑22μm的濾膜。支原體、病毒污染在光學(xué)顯微鏡下難于察覺，細(xì)胞也能生長(zhǎng)繁殖，但會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。檢測(cè)支原體的方法很多，如培養(yǎng)法、PCR法、熒光染色法、電鏡觀察法等。第14頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二血清的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)促生長(zhǎng)效果是血清重要的特性之一，應(yīng)以培養(yǎng)的細(xì)胞來檢測(cè)

克隆形成率：懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，有限稀釋法，統(tǒng)計(jì)克隆生長(zhǎng)百分比。

貼瓶率測(cè)定：貼壁細(xì)胞，集落數(shù)占接種細(xì)胞數(shù)的百分比。

續(xù)傳代培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)七天收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取平均值。連續(xù)測(cè)試三個(gè)周期以上，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。第15頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二血清的外觀好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性。若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象。搖晃時(shí)感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。第16頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二血清的使用與儲(chǔ)存使用前處理：滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的使去除血清中的補(bǔ)體成分。儲(chǔ)存條件：血清一般儲(chǔ)存在-20℃，同時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融。使用前融化，融化時(shí)最好先置于4℃，融化后的血清在4℃不宜長(zhǎng)時(shí)間存放，應(yīng)盡快使用。使用濃度：自從有了合成培養(yǎng)基，血清就是作為一種添加成分與合成培養(yǎng)基混合使用，使用濃度一般為5-20%，最常用是10%。第17頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二使用血清的優(yōu)缺點(diǎn)牛血清的優(yōu)點(diǎn)來源充足制備技術(shù)成熟經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的應(yīng)用有比較深入的理解細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn)改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)含有一些對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒素的物質(zhì)每批血清都有差別，其成分不能保持一致取材過程有可能帶入支原體、病毒第18頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二三、合成培養(yǎng)基

如何選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配制無血清培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基限定化學(xué)成分培養(yǎng)基

第19頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二三、合成培養(yǎng)基第20頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二基本培養(yǎng)基種類第21頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二第22頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二如何選擇培養(yǎng)基第23頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)基的配制第24頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二無血清培養(yǎng)基即不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。如觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾作用，而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子；又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(zhǎng)因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得他們的分泌產(chǎn)物。第25頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二無血清培養(yǎng)基的基本配方基礎(chǔ)培養(yǎng)液以HamF12和DMEM最為常用，一般兩者以1：1混合。添加組分包括以下幾大類物質(zhì)：促貼壁物質(zhì)：貼壁細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子。促生長(zhǎng)因子及激素：針對(duì)不同細(xì)胞添加不同的生長(zhǎng)因子。激素也是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必不可少的，如胰島素。第26頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的，最常用的是大豆胰酶抑制劑。結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清蛋白。牛血清蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。微量元素：硒是最常見的。第27頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二無蛋白培養(yǎng)即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動(dòng)物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清蛋白等。許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)最終要應(yīng)用于人體，如果生長(zhǎng)過程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜。許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長(zhǎng)因子的作用。目前已經(jīng)有適合于CHO細(xì)胞生長(zhǎng)的PFM，PFM只適合于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞。第28頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二限定化學(xué)成分培養(yǎng)基（CDM）培養(yǎng)基中的所有成分都是明確的。它不含有動(dòng)物蛋白，也不添加植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物，目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的CDM，CDM只適合于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞。第29頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二四、其他培養(yǎng)用液平衡鹽溶液消化液pH調(diào)整液第30頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二平衡鹽溶液（BSS）組成：主要由無機(jī)鹽、葡萄糖組成作用：維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)用途：用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑。配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有鈣離子、鎂離子，應(yīng)當(dāng)先溶解這些成分，配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。第31頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二消化液用途：取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液；傳代培養(yǎng)時(shí)也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來。胰酶溶液胰酶的活性可以用消化酪蛋白的能力表示，常見1:125和1:250

組織培養(yǎng)用的胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%的濃度，配制時(shí)要用不含鈣離子和鎂離子及血清的平衡鹽溶液。胰酶作用及溶解的最佳pH8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)整pH8.過濾除菌。第32頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二消化液EDTA溶液：用了解離細(xì)胞，主要是破壞細(xì)胞間的連接。對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA使用濃度為0.02%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。第33頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二膠原酶溶液膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L，作用的最佳pH6.5膠原酶不受鈣離子、鎂離子及血清的抑制，配制時(shí)可以PBS。第34頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二pH調(diào)整液第35頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二第36頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二抗生素第37頁，共41頁，2023年，2月20日，星期二五、