結核病診斷實驗

結核病診斷實驗第1頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二目錄01.分枝桿菌概述02.結核病實驗室檢查03.小結2第2頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二分枝桿菌概述013第3頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二分枝桿菌屬分類結核分枝桿菌(M.tuberculosis)非結核分枝桿菌（NTM）麻風分枝桿菌（M.leprae）4第4頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)1882年德國柯赫醫(yī)生發(fā)現(xiàn)結核致病菌----結核桿菌5第5頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核桿菌的變遷1897年提出結核病的飛沫傳播1922年，卡介苗為預防結核病首次對新生兒接種1945年，鏈霉素的問世使肺結核不再是不治之癥?！?第6頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核分枝桿菌—特點(M.tuberculosis)生物學主要特點：1.細胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的疾病都呈慢性并伴肉芽腫3.抗酸染色陽性7第7頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核病由結核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病8第8頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核病—臨床表現(xiàn)癥狀

體征

1.全身癥狀：消瘦、盜汗、低熱、乏力2.呼吸系統(tǒng)癥狀：咳嗽、約1/3咯血3結核變態(tài)反應表現(xiàn)因肺結核好發(fā)于肺上葉尖后段及下葉背段，故鎖骨上下、肩胛間區(qū)叩診音濁9第9頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核病發(fā)病機制起始期細胞外增殖期和傳播期共生期T細胞反應期10第10頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核病發(fā)病機制結核分枝桿菌通過飛沫進入呼吸道，被肺泡巨噬細胞吞噬殺滅，不留任何痕跡和感染證據(jù)。特點：不存在結核桿菌復制，不存在免疫周圍細胞的免疫應答起始期結核分枝桿菌在體內(nèi)復制，形成感染灶，由T細胞介導的細胞免疫和遲發(fā)型變態(tài)反應，進一步清除細菌。特點：激活體內(nèi)免疫反應（CMI和DTH），宿主獲得抗結核抵抗力反應期11第11頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核病發(fā)病機制在低氧、低pH、抑制性脂肪酸和宿主免疫機制共同作用下抑制細菌的增殖。結核分枝桿菌未被完全清除，細菌和宿主處于共生狀態(tài)，結核桿菌主要存在于壞死組織中央。特點：可激發(fā)和維持T細胞的免疫記憶，在一定條件下再次發(fā)病共生期長期休眠的結核細菌在一定條件下，再次增殖，突破宿主免疫屏障，引起結核病特點：結核播散增殖傳播期12第12頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二接觸活動性結核病患者暴露程度不足，結核桿菌被機體免疫力清除沒有癥狀,結核桿菌仍舊存在而不能被檢測

X-光/CT掃描顯示正常沒有抗體應答診斷困難傳統(tǒng)的結核感染檢測只有TST（PPD）機體被感染受機體免疫力抑制沒有臨床癥狀終身處于感染狀態(tài)潛伏感染有臨床癥狀具有傳染性結核桿菌可以通過涂片、培養(yǎng)檢測出胸部的X-光或CT掃描顯示異常

肺外結核難以診斷(特別是兒童)活動性結核5%5%再次激活活動性結核與潛伏感染13第13頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核病—診斷實驗室檢查影像檢查病理檢查+臨床指征14第14頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核桿菌實驗室檢查02第15頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核診斷--臨床應用幾乎所有的臨床內(nèi)科科室都需要結核的鑒別診斷：發(fā)熱待查，結核排篩結腦的鑒別診斷胸腹水患者待查兒童結核16第16頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核桿菌結核病實驗室檢查細菌學檢查免疫學檢查分子生物學檢查分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定體液免疫學診斷細胞免疫學診斷DNA測序DNA探針技術聚合酶鏈反應（PCR）17第17頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核分枝桿菌-實驗室檢查涂片鏡檢細菌學檢查適用于多種標本；操作簡便，價格低廉。2份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性；1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+肺部影像學檢查符合活動性肺結核表現(xiàn)。肺結核治療評估的主要依據(jù)之一

18第18頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核分枝桿菌-實驗室檢查缺點：不能區(qū)別是否為非結核分枝桿菌不能區(qū)別死活菌。結核桿菌暴露于異煙肼時，某些條件會失去抗酸性，出現(xiàn)假陰性。檢測靈敏度較低（104-105

個細菌/毫升）。19第19頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核桿菌培養(yǎng)細菌學檢查傳統(tǒng)方法：L-J固體培養(yǎng)基快速培養(yǎng)法:

檢測細菌生長過程中代謝產(chǎn)生的CO2或消耗的O2，顯微鏡直接觀察、變色液體培養(yǎng)基等BACTECMGIT960系統(tǒng)

BACTEC460系統(tǒng)、、Bact/ALERT3D、ESPⅡ等。痰培養(yǎng)、其他標本培養(yǎng)20第20頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核桿菌培養(yǎng)陰性培養(yǎng)陽性培養(yǎng)無或微弱熒光FFFO2FO2FO2FO2FO2FFO2FO2CO2O2O2O2O2O2O2O2O2CO2CO2O2FFFFFO2FO2FFFFCO2O2O2O2O2O2強熒光傳感器對氧氣高度敏感的釕復合物肉湯改良Middlebrook7H9肉湯上部空間已預先充填10%CO2BACTEC?MGIT?960/320

指示器系統(tǒng)21第21頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核桿菌培養(yǎng)1份痰標本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+1份痰標本結核分枝桿菌培養(yǎng)

痰涂片陰性，肺部影像學檢查符合活動性肺結核影像學表現(xiàn)+1份痰標本結核分枝桿菌培養(yǎng)陽性用于耐多藥結核療效判定結核菌培養(yǎng)臨床價值—確診結核22第22頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二抗酸桿菌培養(yǎng)優(yōu)缺點敏感性較直接涂片法高，理論上10-100條菌/毫升可檢出陽性；特異性較直接涂片法高，可以從菌落生長速度、色素產(chǎn)生初步判斷非結核分枝桿菌；分離出具有活力的純培養(yǎng)物，為進一步藥敏試驗提供基礎。需時長，根據(jù)接種量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可見菌落。結果受標本保存運送時間、培養(yǎng)基成分和質(zhì)量、前處理方法等影響，操作較直接涂片法復雜，需經(jīng)嚴格培訓。需培養(yǎng)基凝固滅菌器、離心機、渦旋振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱等設備。成本是直接涂片法的7-8倍。23第23頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二細胞免疫學檢查結核菌素皮膚試驗（PPD試驗）γ干擾素釋放試驗（T-SPOT試驗）24第24頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二免疫學檢查細胞免疫學檢查PPD--結核菌素試驗遲發(fā)型細胞超敏反應1）方法：1:2000OT或PPD液0.1毫升(5單位)，左前臂屈側中部皮內(nèi)注射，48-72h測量皮膚硬結的直徑。25第25頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二PPD--結核菌素試驗2）判斷標準：陰性≤4mm弱陽性5-9mm陽性10-19mm，強陽性≥20mm或局部出現(xiàn)水泡與壞死26第26頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二PPD--結核菌素試驗3)結核菌素試驗的意義陰性：無結核菌感染；不能排除結核感染。陽性：曾有結核感染，并不一定現(xiàn)在患病。強陽性：活動性結核病可能

A、變態(tài)反應尚未建立；

B、免疫抑制如應用皮質(zhì)激素或營養(yǎng)不良等

27第27頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二PPD--結核菌素試驗

PPD所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗菌株所共有，其結果受到卡介苗接種及其他分枝桿菌感染的影響，特異性較差。當出現(xiàn)免疫功能低下時可出現(xiàn)假陰性結果，敏感性低。

免疫力正常的陰性有一定意義。強陽性有一定意義。有結核變態(tài)反應、淋巴結核強陽性多。

經(jīng)濟、簡便，可以用于流行病學大規(guī)模的篩查和普查，但存在著明顯的缺陷。PPD試驗臨床價值28第28頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二T-SPOT實驗細胞免疫學檢查T-SPOT試驗原理結核感染者體內(nèi)存在特異的效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-γ）。因此，檢測效應T淋巴細胞可用于結核病或結核潛伏感染者的診斷。既用抗體捕獲培養(yǎng)中細胞所分泌的細胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色方式將其表現(xiàn)出來。刺激抗原：ESAT-6蛋白(早期分泌抗原靶6）、CFP-10蛋白（培養(yǎng)濾液蛋白）由結核分枝桿菌特有的RD1基因編碼，可刺激活化的效應T淋巴細胞產(chǎn)生γ干擾素。

RD1基因在BCG以及大部分環(huán)境分枝桿菌中缺失。29第29頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二T-SPOT試驗γ干擾素檢測陰性γ干擾素檢測陽性TB抗原多肽T細胞活化T細胞γ干擾素30第30頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二T-SPOT步驟31第31頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二T-SPOT靈敏度ReferenceSensitivityJafarietal2006AJRCCM174;9:1048-53100.0%(12/12)FerraraetalLancet2006376;1328-34*83.3%(20/24)LeeetalEurRespirJ200628;24-30*96.6%(84/87)GolettietalClinMicrobiolInfect200612;6:544-50*91.3%(21/23)MeieretalEJCMID200524;529-53695.9%(70/73)KangetalChest.2007Sep;132(3):959-65*92.2%(59/64)JanssensetalERJ200730(4):722-898.3%(57/58)ClarkeetalClinExpImmunol2007150(2):238-44.90.0%(27/30)DetjenetalCID20071;45(3):322-8*92.9%(26/28)OzekincietalJIntMedRes2007;35:696-70392.9%(26/28)SoysaletalIJTLD200812(1):50-56*80.8%(80/99)DominguezetalClinVaccImmunol200815(1);168-71*85.7%(36/42)CheeetalJClinMicrobiol.2008Apr9*94.1%(254/270)VincentietalClinExpImmunol.2007Oct;150(1):91-8*84.6%(11/13)WangetalEmergingInfectDis200713;4:553-887.2%(34/39)LosietalEurRespirJ.2007Dec;30(6):1173-9100.0%(10/10)KimetalArchInternMed167;20:2255-2259100.0%(22/22)ConnelletalPLoSONE2008.3;7:e2624*100.0%(9/9)Kobashietal.ScandJInfectDis2008.40;8:629-34*87.5%(42/48)Kobashietal.JInfect.2008[Epubaheadofprint].*90.0%(36/40)Domínguezetal.DiagnMicrobiolInfectDis.2008.*[Epubaheadofprint]84.2%(32/38)Golettietal.PLoSONE.2008.3;10:e3417.*89.9%(62/69)Bosshardetal.RespirMed.2008.[Epubaheadofprint]98.4%(62/63)HiguchiMedMicrobiolImmunol.2008.[Epubaheadofprint]*95.9%(47/49)TOTAL92.0%(1139/1238)靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結核患者中有很高的檢出率

美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)32第32頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二結核桿菌特異性高只針對結核分枝桿菌復合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508)33第33頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二PPD皮試與T-SPOT試驗PPD皮試T-SPOT試驗估計的敏感性(活動性結核的患者）75~90%（對免疫抑制患者的敏感性進降低明顯）75~95%（對免疫抑制患者的敏感性降低不明顯）估計的特異性（無結核病史或暴露史的健康人）70~95%（接種BCG者的特異性進一步降低）90~100%（接種BCG者的特異性不變）與BCG的交叉反應存在存在的可能性較小與NTM的交叉反應存在存在的可能性較小與M.TB暴露的相關性存在相關性較PPD皮試大陽性結果與隨訪期間罹患結核的相互關系中到顯著的正相關無充足的證據(jù)可重復性中等，但可變較高，但證據(jù)較少

PPD皮試和T-SPOT試驗的比較34第34頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二T-SPOT試驗結果解釋陰性結果提示患者體內(nèi)不存在針對結核桿菌特異的效應T細胞。假陰性結果：①感染階段不同；②少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/疾??；③實驗非正常操作。陽性結果提示患者體內(nèi)存在針對結核桿菌特異的效應T細胞，患者存在結核感染。但是否是活動性結核病，需結合臨床癥狀和其它檢測指標綜合判斷。假陽性結果：①4種環(huán)境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）減少了醫(yī)生主觀因素對檢測結果的影響;故雖然檢測儀器昂貴，操作相對較為復雜，但仍可視為進行結核病早期診斷的較為理想的手段。35第35頁，共39頁，2023年，2月20日，星期二非血液樣本檢測T-SPOT可通過一些體液成功地診斷出活動