流式細(xì)胞術(shù)在出血與血栓性疾病中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)在出血與血栓性疾病中的應(yīng)用第1頁/共58頁

FCM在出血與血栓性疾病中的應(yīng)用

集激光、電子物理、光電測量、計算機(jī)、細(xì)胞熒光化學(xué)及單克隆抗體為一體的新技術(shù)。對處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速、靈敏、多參數(shù)定量分析和分選技術(shù)。

開創(chuàng)了對單個BPC或亞群分析的新途徑。第2頁/共58頁

FCM分析BPC的主要項目血小板計數(shù)：CD41、CD61射門網(wǎng)織血小板（RNA噻唑橙黃染料）：含RNA的BPC自身抗體:特異性血小板抗體、PAIg、同種抗體免疫表型分析：膜糖蛋白表達(dá):GPIb/IX/V復(fù)合物(CD42a、CD42b、CD42c、CD42d))GPIIb/IIIa復(fù)合物（CD41、CD61）FV、IIIaBPC活化：膜糖蛋白表達(dá)（P-選擇素，CD62p）BPC內(nèi)物質(zhì)，微粒對不同刺激劑的反應(yīng)性：胞質(zhì)鈣流第3頁/共58頁

FCM在出血性疾病中的應(yīng)用1、血小板減少：血小板數(shù)量、網(wǎng)織血小板2、血小板功能缺陷

血小板無力癥：GPIIb-IIIa（CD41-CD61）巨大血小板綜合征：GPIb-IX（CD42b-D42a3、血小板抗體：血小板相關(guān)免疫球蛋白（PAIg）血小板糖蛋白特異性自身抗體（GP）4、血小板采集、儲存與輸注的監(jiān)測.第4頁/共58頁出血性疾病的分類

血管壁功能異常遺傳性（毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、家族單純性）獲得性（過敏性紫癜、血管炎、免疫性）

數(shù)量

遺傳性、獲得性Aa、巨核、免疫性、ITP、DIC

血小板異常數(shù)量（ET，CML）

功能異常（GT、BS、顆粒性）凝血功能障礙遺傳性（血友病、VWD、其他凝血因子缺乏）獲得性（VK缺乏，肝臟病，DIC、藥物）循環(huán)中病理性抗凝物質(zhì)凝血因子抑制物肝素樣抗凝物質(zhì)；狼瘡樣抗凝物纖維蛋白（原）溶解亢進(jìn)遺傳（t-PA/u-PA↑抗纖溶酶）獲得（DIC，血栓癥）第5頁/共58頁血小板計數(shù)BPC直徑1-4m，與RBC，WBC或碎片、免疫復(fù)合物大小相等，影響計數(shù)準(zhǔn)確性。

FCM優(yōu)點(diǎn)：

利用各種BPC特異性單克隆抗體→直接標(biāo)記熒光素分子快速、準(zhǔn)確，排除非BPC顆粒干擾，誤差<5%，尤其適合BPC＜20X109/L重復(fù)性好

缺點(diǎn)：技術(shù)條件要求高，費(fèi)用高。第6頁/共58頁

FCM分析血小板原理

利用熒光素標(biāo)記的BPC特異性單抗或與待測成分特異性結(jié)合且能發(fā)熒光的物質(zhì)+分離BPC或全血→去除未反應(yīng)的單抗或熒光物質(zhì);→特異檢測5000-10000BPC光散射與熒光信號（單色或多色）;→獲取,統(tǒng)計數(shù)據(jù),分析,→根據(jù)光散射與熒光強(qiáng)弱→計算陽性BPC百分比或所測成分的含量（GP/BPC).第7頁/共58頁

FCM分析血小板方法

抗凝血2ul調(diào)節(jié)BPC105-106/ml2-80C預(yù)冷的1%多聚甲醛1ml固定，2hBPC特異單抗+熒光劑(異硫氰酸熒光素)(CD42bFITC)+SSC+FSC設(shè)門-特異性選擇BPC.檢測10000-100000BPC表面熒光信號.FCM獲取，分析數(shù)據(jù)結(jié)果表示:平均顆粒熒光強(qiáng)度-活化時GP:Ag量特異性熒光抗體結(jié)合陽性BPC%-x.第8頁/共58頁

血小板光散射圖第9頁/共58頁

FCM分析血小板的客觀評價利用各種BPC特異性單克隆抗體→直接標(biāo)記熒光素分子優(yōu)點(diǎn)：1、接近生理條件直接測定血小板:2、微量（2ul)3、快速、準(zhǔn)確，排除非BPC顆粒干擾，誤差<5%，主觀因素少靈敏度高、尤其適合BPC＜20X109/L、重復(fù)性好4、克服BPC?。画h(huán)境影響（血管壁、剪切力、刺激劑→變形、黏附、聚集、釋放、血小板活化與反應(yīng)性不足：1、技術(shù)要求高,費(fèi)用高。2、不能反映與血管壁相互作用

，第10頁/共58頁血小板功能缺陷黏附異常巨大血小板綜合征GP1b-FX血管性血友?。╲WD）vWF量、質(zhì)異常血小板型vWDGPIIb-FIX自發(fā)結(jié)合vWF聚集異常血小板無力癥GPIIb-IIIa缺乏顆粒異?；疑“寰C合癥顆粒儲存異?；虺煞秩狈Υ娉夭?/p>

、致密體顆粒缺乏受體與信號傳遞異常

環(huán)氧化酶缺乏癥環(huán)氧化酶缺乏合成酶缺乏癥合成酶缺乏信號傳導(dǎo)缺陷癥花生四烯酸不能動員膜磷脂異常

第11頁/共58頁第12頁/共58頁第13頁/共58頁第14頁/共58頁血小板膜糖蛋白分析GP受體是血小板功能基礎(chǔ)，分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量異常，可導(dǎo)致出血或血栓。GPIIb/IIIa復(fù)合物(CD41/CD61)GPIb/IX/V復(fù)合物(CD42a/CD42d)GPIa/IIa復(fù)合物(CD49b/CD29)GPIc/IIa復(fù)合物(CD49e/CD49f/CD29)GPIV(CD36)2種單抗雙色FCM：一種單抗為血小板標(biāo)志性抗體設(shè)定閾值（鑒別血小板）；一種為檢測抗體。第15頁/共58頁

FCM分析血小板膜糖蛋白

熒光標(biāo)記的抗BPC糖蛋白抗體(McAb)+GP特異性結(jié)合FCM上測定結(jié)合熒光素的陽性BPC%與強(qiáng)度。直接法或標(biāo)記二抗間接法.

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高:可測BPC上微弱熒光強(qiáng)度。特異性強(qiáng):FS+SS與其他細(xì)胞、碎片區(qū)分準(zhǔn)確度高:數(shù)萬BPC表示結(jié)果:%+強(qiáng)度操作:簡單，快速。第16頁/共58頁

雙色熒光分析血小板膜糖蛋白第17頁/共58頁

血小板分化抗原及其單抗第18頁/共58頁

FCM分析血小板膜糖蛋白臨床應(yīng)用遺傳性血小板功能缺陷：黏附功能缺陷：巨血小板綜合征（GPIb/IX/V復(fù)合物缺陷）聚集功能缺陷：血小板無力癥（GPIIb/IIIa復(fù)合物缺陷）儲存池?。褐旅茴w粒缺陷血小板促凝活性異常：PF3缺乏；活化的血小板不能結(jié)合AnnexinV/FV/Va，F(xiàn)X/Xa獲得性血小板功能缺陷：肝、腎臟病、藥物（ASA)

第19頁/共58頁

GPIIb-IIIa

BPC活化GPIIb-IIIa上Fg受體暴露GPIIb-IIIa+FgBPC聚集。1，直接檢測GPIIb-IIIa--GT2，間接檢測結(jié)合在BPC表面的Fg：

FCM同時測GPIIb-IIIa+結(jié)合Fg:

GPIIb-IIIa量正常+Fg結(jié)合能力GPIIb-IIIa質(zhì)異常--變異性GT

抗GPIIb-IIIa單抗檢測簡單、快速、敏感。根據(jù)結(jié)合率判斷純合子與雜合子狀態(tài)。第20頁/共58頁第21頁/共58頁血小板無力癥（GT）

1918年瑞士Glanzmann報道BPC膜GPIIb-IIIa缺乏或質(zhì)缺陷，BPC活化后不能結(jié)合BPC黏附蛋白（Fg、vWF）

BPC聚集功能障礙。診斷：血小板正常，散在分布；出血時間延長；對各種聚集劑不聚集或嚴(yán)重減低；重癥BPC中無Fg。

確診：GPIIb-IIIa缺乏或減少（FCM）治療：輸注BPC；DDAVP；rFVIIa第22頁/共58頁

病例1、血小板無力癥（GT）患者，男，17歲，自幼反復(fù)鼻出血、牙齦出血，黑便2天。父母近親結(jié)婚，家族中無類似病史。查體：重度貧血貌，皮膚可見陳舊淤班,余正常。實(shí)驗(yàn)室檢查：BPC84X109，血小板形態(tài)正常

PT12.3”，KPTT35”

，vWF105%，BT12’，

ADP誘導(dǎo)不聚集,Ristocetin誘導(dǎo)聚集正常，

GPIIb/IIIa（CD41）13%，平均熒光強(qiáng)度1.32，診斷：GT，IDA治療：輸注血小板，F(xiàn)e劑第23頁/共58頁第24頁/共58頁第25頁/共58頁

血小板無力癥膜糖蛋白分析熒光散點(diǎn)圖第26頁/共58頁巨大血小板綜合癥

（Bernard-Soulier綜合癥，BSS）

BPC膜GPIb、GPIb

、GPIX基因缺陷，常染色體隱性遺傳。GPIb/IX/V復(fù)合物量或質(zhì)缺陷,BPC不能與vWF結(jié)合,黏附功能減低。實(shí)驗(yàn)室：出血時間延長、BPC減少、巨大BPC、BPC壽命縮短、除Ristocetin外,其他聚集劑反應(yīng)正常

GPIb(聚丙烯酰胺凝膠電泳)

確診：GPIb（CD42b-CD42a）FCM

治療：輸注血小板

第27頁/共58頁

巨大血小板綜合征糖蛋白分析第28頁/共58頁儲存池病

(storagepooldisease,SPD)BPC缺乏致密顆粒。熒光法:熒光染料鹽酸阿地平標(biāo)記BPC，顯微鏡觀察。FCM：直接測定致密顆粒第29頁/共58頁血小板自身抗體測定包括：針對人類組織相容性抗原的抗體：血小板表面相關(guān)抗體（PAIgG)針對血小板膜糖蛋白抗體：GPIIb/IIIa

第30頁/共58頁血小板特異性抗體與ITPITP：血小板特異性抗體介導(dǎo)血小板破壞增加機(jī)制：(1)自身抗體包備在血小板上，抗體Fab端與巨噬細(xì)胞Fc受體(FcR)結(jié)合，血小板被吞噬破壞；(2)抗原-抗體復(fù)合物激活補(bǔ)體C1q及各成分，C3b附著于血小板表面，與巨噬細(xì)胞C3b受體結(jié)合，血小板被吞噬；(3)巨核細(xì)胞與血小板有相同抗原性，血小板抗體通過Fab端與巨核細(xì)胞結(jié)合，巨核細(xì)胞成熟障礙。第31頁/共58頁

血小板表面免疫球蛋白（PAIg）抗自身BPC抗體引起免疫性血小板破壞

PAIg(BPC表面結(jié)合的IgG)FCM：陽性細(xì)胞百分率與熒光強(qiáng)度增加，雙峰或峰型異常（破壞與生成均增加）敏感性>ELISA(單個BPC上PAIg)

MAIPA（單抗特異性捕獲血小板抗體試驗(yàn)）

PAICA（BPC相關(guān)IgG特異性試驗(yàn)）特異性<MAIPA<PAICA

血小板抗體免疫流式檢測法（PAICA)第32頁/共58頁

FCM檢測PAIg在診斷ITP中的評價

1、用于嚴(yán)重BPC減少者PAIgG檢測；2、特異性<特異性結(jié)合抗體（MAIPA、PAICA）特異性78-93%。敏感性49-66%；可鑒別免疫與非免疫性BPC減少；3、陰性不能排除；在診斷ITP中僅有參考價值。目前國外（英國）已不作為ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)。第33頁/共58頁特異性自身抗血小板膜糖蛋白抗體與ITPGPIIb/IIIa為一種重要的靶抗原，抗體封閉GPIIb/IIIa，血小板數(shù)量減少；血小板粘附、聚集功能抑制。ITP患者血漿存在特異性抗GPIIb/IIIa抗體(CD61/CD41），抗GPIb、抗GPIX抗體。

利用PE標(biāo)記的CD61抗體：非ITP血小板減少組CD61表達(dá)率顯著高于ITP組（P>0.05），CD61敏感性86.2%，特異性90%。（薛磊、朱微波）

第34頁/共58頁網(wǎng)織血小板（RP)檢測

骨髓最早釋放到外周血中含mRNA的新生BPC，用熒光染料噻唑橘紅或金胺橙標(biāo)記BPCRNA。反映骨髓血小板生成狀態(tài)的指標(biāo)。傳統(tǒng)方法：1、手工計數(shù)；2、自動計數(shù)FCM臨床應(yīng)用：1、ITP2、干細(xì)胞移植：預(yù)測骨髓造血恢復(fù)，在血小板恢復(fù)前增高；移植后10-26天,RP由2.9±1.713.6±6.4,達(dá)峰值后3天。血小板45.６Ｘ１０９/L,

RP逐漸降低。3、化療后骨髓抑制與恢復(fù)；4、肝移植第35頁/共58頁網(wǎng)織血小板檢測臨床意義ITP：BPC破壞外周血新生BPC含mRNA的BPC熒光強(qiáng)度、百分率增加，且與BPC呈負(fù)相關(guān)：BPC，網(wǎng)織BPC-負(fù)相關(guān)治療有效：BPC，網(wǎng)織BPC。治療無效：BPC，網(wǎng)織BPC持續(xù)。

Aa：BPC，網(wǎng)織BPC

第36頁/共58頁

FCM檢測在ITP診斷中的意義

1、PAIgG50-60%陽性，可鑒別免疫與非免疫性BPC減少，敏感性49-66%；特異性78-93%；2、特異性抗GPIIb/IIIa抗體(CD61/CD41）

敏感性86.2%，特異性90%；3、網(wǎng)織BPC;BPC-負(fù)相關(guān)；4、BPC微粒（PMPS）：BPC破壞產(chǎn)生BPCPMPS。

第37頁/共58頁FCM在血栓性疾病中的應(yīng)用1、血栓前（高凝）狀態(tài)：BPC“活化”是參與血栓的前提，BPC活化指標(biāo)：

TXB2、GP（IIb/IIIa、Ib、V）、-TG、PF4、GMP-140；2、冠心病：P-sel；CD41/CD61；sGC均不穩(wěn)定心絞痛：P-sel，GPVAMI：P-sel，GPV；溶栓再通：1-6h，P-sel，GPV

溶栓未通：P-sel，GPV；3、腦缺血：活化標(biāo)志物均；4、糖尿?。篜-sel；BPC活化與血管病變有關(guān)

DM無血管病變：P-sel；DM+血管病變：P-sel

第38頁/共58頁

FCM分析血小板活化原理

血小板活化過程中生理、生化改變：1、最早期反應(yīng)：Ca++流2、形態(tài)改變（圓盤→偽足）：光散射改變3、膜糖蛋白改變：GPIb/IX/V↓；GPIIb/IIIa↑+構(gòu)型改變4、顆粒膜蛋白表達(dá)：活化血小板標(biāo)志物釋放反應(yīng)→a顆粒、溶酶體膜蛋白（CD62P、CD63）↑5、暴露促凝表面：PS、PI暴露于膜表面

→促進(jìn)FV/Va、FVIII/VIIIa、FX/Xa、FIIa+Ca++→參與凝血第39頁/共58頁

血小板活化第40頁/共58頁a-granuleWeibel-PaladebodyEndothelialcellsPlateletsThrombinP-Selectin–活化血小板的表面標(biāo)志

RestingActivatedP-Selectin第41頁/共58頁

FCM血小板活化分析

血小板活化:受體介導(dǎo)的靜止血小板對各種刺激物的反應(yīng)。激活顆粒膜蛋白(CD62P)在質(zhì)膜上表達(dá)活化標(biāo)志物;

GP構(gòu)型改變與血漿中相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合BPC聚集；

BPC內(nèi)分泌反應(yīng);

BPC膜內(nèi)、膜表面、血漿中GP成分改變BPC活化的標(biāo)志物。

利用各種活化依賴型單抗可反映BPC活化程度。第42頁/共58頁

血小板活化標(biāo)志物-TG、PF4、TXB2、血小板+白細(xì)胞(CD11c/CD18)-NC激活,介導(dǎo)炎癥,血栓.活化依賴的GPIIb/IIIa復(fù)合物（GPIIb/IIIa）P-選擇素（P-sel、GMP-140，金標(biāo)準(zhǔn)）糖盞蛋白（GC）

糖蛋白V（GPV）BPC微顆粒（PMP）胞質(zhì)內(nèi)游離鈣濃度:Fluo-3-Am連續(xù),動態(tài),早期第43頁/共58頁

血小板表面活化依賴的變化第44頁/共58頁

P-選擇素（P-selectin）

（顆粒膜糖蛋白，GMP-140，D62p）

整合型-跨膜區(qū)域，靜止BPC顆粒和活化的BPC質(zhì)膜上；靜止BPC被凝血酶活化顆粒與質(zhì)膜融合BPC膜表達(dá)P-sel活化BPC特異性標(biāo)志物(金標(biāo)準(zhǔn)分子)可溶性-無跨膜區(qū)域(sP-selectin)，

BPC活化時釋放到血漿中反映BPC活化的分子標(biāo)志物。第45頁/共58頁a-granuleWeibel-PaladebodyEndothelialcellsPlateletsThrombinP-SelectinIsaSurfaceMarkerforActivatedPlateletsRestingActivatedP-Selectin第46頁/共58頁

各組sP-selectin比較（X±S，μg/L）

組別例數(shù)P-選擇素

control5015.62±5.89UA1530.73.±10.14*

AMI3754.56±11.87*

*與正常對照組比較P<0.01第47頁/共58頁血小板糖盞蛋白

（glycocalicin，GC）GPIb（GPIb，）胞外部分與vWF、凝血酶結(jié)合位點(diǎn)GPIb對多種蛋白酶敏感，水解后釋放GC。直接反映蛋白酶活化和BPC破壞的分子標(biāo)志物,判斷BPC活化或黏附功能受損,有助于血栓研究.第48頁/共58頁

sGC正常值的建立及臨床應(yīng)用

表1.各組血漿sGC水平比較（X±S，μg/L）

組別例數(shù)sGC

control50824.50±225.11

UA152073.34±721.14*

AMI372415.60±887.62*

*與正常對照組比較P<0.01第49頁/共58頁血小板糖蛋白V（GPV）與凝血酶受體GPIb-IX-V復(fù)合物中亞單位（GPIb-IX；GPV）。GPV促進(jìn)BPC表面GPIb-IX表達(dá)；增加與vWF結(jié)合；BPC活化負(fù)調(diào)控因子。凝血酶活化BPC→裂解GPV在膜外部分→水解片段入循環(huán)→sGPV活化BPC新的分子標(biāo)志物.冠狀動脈粥樣硬化時血漿GPV增高。第50頁/共58頁第51頁/共58頁表2.各組sGPV水平比較（X±S，μg/L）

組別例數(shù)sGPV

control5028.5±5.89

UA15118.47±58.93*

AMI3760.01±43.35*

*與正常對照組比較P<0.01第52頁/共58頁血小板微顆粒

（plateletmicroparticle，PMP）血小板受刺激變形時成小泡或偽足,脫落入循環(huán)的聚合體（1967年,Wolf）0.1-1.0ug:表達(dá)特異性GP（GPIIb/IIIa、Ib、P-selectin）;富含PF3,為BPC活化和凝血提供催化表面,具有凝血與抗凝雙重活性。FIT