第九講凝膠電泳技術(shù)

第九講凝膠電泳技術(shù)第1頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

凝膠電泳(gelelectrophoresis)技術(shù)第2頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

核酸分子雜交技術(shù)第3頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

蛋白分子雜交技術(shù)第4頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

細(xì)胞轉(zhuǎn)化（原核）/轉(zhuǎn)染（真核）第5頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一PCR擴(kuò)增第6頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一DNA測序DNA測序儀第7頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

蛋白測序第8頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

文庫構(gòu)建第9頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

酵母雙雜交第10頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一RNA干擾(RNAi):轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)第11頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

第一節(jié)凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳（Gelelectrophoresis）

是以凝膠為載體，以電流為驅(qū)動(dòng)，用于分離不同大小、形狀、等電點(diǎn)等分子的技術(shù)。凝膠電泳通常用于分析用途。但也可以作為制備技術(shù)，如在使用質(zhì)譜(MS)、PCR、克隆、DNA測序、免疫印跡等檢測之前用于提純分子。第12頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一一、核酸的凝膠電泳

基本原理

在buffer為PH8.0時(shí)，帶有負(fù)電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反應(yīng)活性的穩(wěn)定介質(zhì)（瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，在電場中以一定的遷移率從負(fù)極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。

第13頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一電泳槽電泳儀梳子電泳槽制膠板正極電源插孔負(fù)極電源插孔電源線電泳槽第14頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一第15頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一第16頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

電泳的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型

①分子量較小的DNA分子比分子量較大的DNA分子遷移率要快；

②同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子，構(gòu)型緊密的比線性DNA分子要快，線性DNA分子比開環(huán)DNA分子要快。

第17頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一圖2線性DNA電泳圖第18頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

凝膠電泳的分辨力：

與凝膠的類型和密度相關(guān)

瓊脂糖凝膠的分辨力在0.2～50Kb之間;

聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之間第19頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一聚丙烯酰胺凝膠電泳圖（高分辨率，1bp差異可區(qū)分）瓊脂糖凝膠電泳圖第20頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一（一）瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。分為常熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)（LMP）瓊脂糖。第21頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一LMP瓊脂糖熔點(diǎn)：62～65℃

熔解后，在37℃

可保持液態(tài)數(shù)小時(shí)；在25℃

可保持液態(tài)約10min

應(yīng)用：直接酶切，回收DNA分子；在65℃

下將LMP瓊脂糖凝膠熔化；加入過量的酚抽提DNA；離心獲得含DNA分子的上清液。第22頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一瓊脂糖凝膠電泳圖第23頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)：緩沖液：1×

TAE或TBE

凝膠的含量：根據(jù)檢測的DNA大小加DNA樣品：<1μg，指示劑電泳條件：大片斷低電壓長時(shí)間，小片段高電壓短時(shí)間染色和觀察：溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波長的紫外下觀察（凝膠成像儀）。能看到0.05

μg的微量DNADNA的片斷大小與熒光強(qiáng)度成正比

第24頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一TAE:電泳大于13kb的片段時(shí)用TAE緩沖液將取得更好的分離效果。TAE的缺點(diǎn)是緩沖容量小，長時(shí)間電泳（如過夜）不可選用，除非有循環(huán)裝置使兩極的緩沖液得到交換。

TBE:緩沖能力強(qiáng)，長時(shí)間電泳時(shí)可選用TBE，并且當(dāng)用于電泳小于1kb的片段時(shí)分離效果更好（常用）。TPE的緩沖能力也較強(qiáng)，但由于磷酸鹽易在乙醇沉淀過程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的電泳中使用。電泳反沖液第25頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一SeparationRangeVs.%AgaroseLowGelingAgarose4-6 0.02-0.4第26頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一注意：EB（Ethidiumbromide，溴化乙錠）為強(qiáng)致癌物?。?！第27頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一Agarosegelelectrophoresis第28頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一第29頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一第30頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一第31頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一凝膠成像儀第32頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一

用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA對DNA片斷大小的估算

第33頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一二、瓊脂糖凝膠電泳的的影響因素瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:

1、DNA的分子大小:

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

第34頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一2、瓊脂糖濃度

一個(gè)給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

第35頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一3、DNA分子的構(gòu)象

當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的,超螺旋DNA移動(dòng)快,而線狀雙鏈DNA移動(dòng)要慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí),可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。

第36頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一4、電源電壓

在低電壓時(shí),線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到最大,所加電壓不得超過5v/cm。

第37頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一5、嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。

第38頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一6、離子強(qiáng)度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。

第39頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)分子雜交

一

Southern雜交二Northern雜交三

菌落原位雜交四

Western雜交第40頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一分子雜交

(moleculehybridization)【分子雜交】是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用已知標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子，以及其相對分子量大小。根據(jù)其檢測對象的不同可分為

Southern雜交、Northern雜交和Western雜交，及由此演化的斑點(diǎn)雜交和菌落雜交等。

第41頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行，也可能在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行?！竞怂岱肿与s交】是指核酸分子(DNA或RNA)在變性以后，在復(fù)性的過程中兩個(gè)不同來源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過程。通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。第42頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一第43頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一探針標(biāo)記方法體內(nèi)(invivo)標(biāo)記是將放射性標(biāo)記的化合物作為代謝底物加到活細(xì)胞培養(yǎng)體系中去，經(jīng)細(xì)胞的合成代謝而使核素?fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又腥?。體外標(biāo)記法分為化學(xué)法和酶法：①化學(xué)法。最常用的是125I標(biāo)記和光敏生物素(photobiotin)標(biāo)記。②酶法也叫酶促標(biāo)記法，將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記到核苷酸(NTP或dNTP)分子上，然后利用酶促反應(yīng)將標(biāo)記的核苷酸分子摻人到探針分子中去，或?qū)⒑塑账岱肿由系臉?biāo)記基因交換到探針分子上。

第44頁，共46頁，2023年，2月20日，星期一(1)缺口平移法：DNaseI是在兩條鏈的不同部位隨機(jī)打開缺口，從而使兩條鏈都被核素均勻地標(biāo)記，使得標(biāo)記的DNA具有較高的放射比活性。3種三磷酸脫氧核糖核苷酸如dATP、dTTP、dGTP，一種核素標(biāo)記的核苷