植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)課件

轉(zhuǎn)基因技術(shù)與作物育種1轉(zhuǎn)基因育種的概念與優(yōu)點(diǎn)轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的一般操作過程轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的應(yīng)用成果轉(zhuǎn)基因的安全性2作物轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標(biāo)，從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運(yùn)載進(jìn)入受體作物，經(jīng)過篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的遺傳工程體，并經(jīng)過田間試驗(yàn)與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)基因作物（GMC，geneticallymodifiedcrops）第一節(jié)植物轉(zhuǎn)基因育種概念及優(yōu)點(diǎn)3TraditionalcrossbreedingRecombinantDNAtechniques5第二節(jié)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一般操作過程67技術(shù)路線目的基因分離植物表達(dá)載體的構(gòu)建受體材料的準(zhǔn)備遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化組織組織脫分化轉(zhuǎn)化植株篩選煉苗8①②pGEM-T③④⑤⑥⑥⑦⑧①銀杏葉RNA提?、诜崔D(zhuǎn)錄cDNA③chs全長cDNA的克隆④TA克隆及測序⑤向chs兩端引入酶切位點(diǎn)⑥雙酶切⑦定向克?、鄬?dǎo)入農(nóng)桿菌

2.植物表達(dá)載體的構(gòu)建103.受體材料的準(zhǔn)備細(xì)胞的全能性：分化細(xì)胞脫分化

再分化11根癌農(nóng)桿菌

(Agrobacteriumtumefaciens),是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,它含有Ti質(zhì)粒,能誘導(dǎo)被侵染的植物細(xì)胞形成腫瘤,即誘發(fā)冠癭瘤.Ti質(zhì)粒(包括Ri質(zhì)粒)上有一段轉(zhuǎn)移DNA,在農(nóng)桿菌侵染宿主植物時(shí),這段DNA可以轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞,并穩(wěn)定地保留在植物細(xì)胞染色體中,變?yōu)橹参锛?xì)胞新增加的一群基因,最終能通過有性世代遺傳給子代。返回13基因槍轉(zhuǎn)化法由美國Cornell大學(xué)的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒(鎢?；蚪鹆?表面,通過高壓驅(qū)動力加速微粒穿透植物細(xì)胞壁,導(dǎo)入受體組織細(xì)胞內(nèi),然后通過組織培養(yǎng)再生出完整的植株.微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后,整合到染色體上并得到表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)化.。返回14電擊法的主要原理是將原生質(zhì)體在溶液中與DNA混合,然后利用高壓電脈沖作用,使原生質(zhì)體膜的某些部位被擊穿而產(chǎn)生可回復(fù)的小孔,外源DNA可通過小孔進(jìn)入原生質(zhì)體內(nèi),而且不影響經(jīng)電擊處理的原生質(zhì)體再生植物的能力.返回15PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鳥核苷酸(pLO)、磷酸鈣及高pH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子.PEG可促使細(xì)胞膜與DNA間接觸與粘連,并通過引起膜表面電荷的紊亂及干擾細(xì)胞間的識別,利于細(xì)胞膜間的融合以及外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體.返回17表1幾種植物轉(zhuǎn)基因方法比較

185.轉(zhuǎn)化組織——農(nóng)桿菌介導(dǎo)之葉盤轉(zhuǎn)化法帶有轉(zhuǎn)化基因的農(nóng)桿菌活化受體植物葉盤侵染共培養(yǎng)篩選培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗預(yù)培養(yǎng)葉盤，或愈傷組織19216.煉苗22

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀第三節(jié)作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用成果自從1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來，至今已有120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。1996年全球大面積種植，并不斷擴(kuò)大。國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)局（ISAAA）統(tǒng)計(jì)結(jié)果23在2008年，轉(zhuǎn)基因作物種植國的數(shù)量激增到了25個(gè)。其中，種植面積排名前三位的國家分別為，美國（6250萬公頃）、阿根廷（2100萬公頃）和巴西（1580萬公頃）。中國全國生物技術(shù)作物種植面積達(dá)380萬公頃，在全球生物技術(shù)作物種植面積超過100萬公頃的八個(gè)國家中排名第六。歐洲很少與世界上其他商業(yè)化種植Bt玉米的國家相比，歐盟的種植規(guī)模很小。2008年大約10萬公頃Bt玉米在歐盟國家被種植。與美國相比，歐盟的轉(zhuǎn)基因安全管理法規(guī)和制度仍然是非常嚴(yán)格的。25美國：3900萬公頃加拿大：350萬公頃阿根廷：1350萬公頃中國：210萬公頃26Firstbiotechplantproduct–Flav’rSav’rtomato29我國轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況

我國是世界上第一個(gè)商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國家。自行培育的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草的抗病蟲性達(dá)到60％，產(chǎn)量比對照增加15％，產(chǎn)值增加20％，1992年每畝增收200元，遺憾的是由于市場的原因現(xiàn)已不推廣。到1999年我國已批準(zhǔn)中試的轉(zhuǎn)基因作物有48項(xiàng)：包括水稻、小麥、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、煙草、廣藿香等11種作物；主要目標(biāo)性狀是抗蟲、抗病、耐鹽、抗凍、耐儲藏和抗衰老等。已批準(zhǔn)環(huán)境釋放的有49個(gè)品種，涉及水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹、煙草等10種作物。30經(jīng)全國基因工程安全委員會批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)的作物已有：

我國自行研制開發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花（轉(zhuǎn)Bt及Bt+CpTI雙價(jià)抗蟲棉）；

2004年種植轉(zhuǎn)基因棉花370萬公頃，占棉花種植面積的50%美國Monsanto公司開發(fā)的Bt抗蟲棉；延遲成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄；抗黃瓜花葉病毒(CMV)轉(zhuǎn)基因番茄；抗CMV轉(zhuǎn)基因甜椒；轉(zhuǎn)查爾酮合酶（CHS）反義RNA基因矮牽牛。31由中國農(nóng)科院生物工程中心開發(fā)的Bt棉對棉鈴蟲有顯著的抗性。與對照相比減少農(nóng)藥用量80％，并減少用工150個(gè)/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡迎。32第四節(jié)轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性33直至今天，轉(zhuǎn)基因作物的安全性在全球范圍內(nèi)引起了激烈的爭論。反對者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物具有極大的潛在危險(xiǎn)，可能會對人類健康和人類生存環(huán)境造成威脅。在歐洲，轉(zhuǎn)基因作物被一些媒體稱之為“惡魔食品”（frankensteinfood）。Frankenstein是英國科幻小說中由一個(gè)科學(xué)家創(chuàng)造、最終又毀滅了這個(gè)科學(xué)家的怪物。那么，人類研制與種植轉(zhuǎn)基因作物到底是毀滅自己，還是拯救自己呢？34對轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭論，國際上有幾個(gè)典型的事件。

Pusztai事件：英國Rowett研究所有位Pusztai博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英國電視臺發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。后果：綠色和平組織、地球之友等反生物技術(shù)組織把這種土豆說成“殺手”，并策劃了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗(yàn)地等行動，焚燒了印度的兩塊試驗(yàn)田，甚至美國加州大學(xué)戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)材料也遭破壞，以致研究生畢業(yè)論文都無法如期完成。英國皇家學(xué)會組織了同行評審，并于1999年５月發(fā)表評論，指出Pusztai的試驗(yàn)有六方面的錯(cuò)誤：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的化學(xué)成分有差異；對食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補(bǔ)充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標(biāo)準(zhǔn)食物，缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；試驗(yàn)設(shè)計(jì)差；統(tǒng)計(jì)方法不當(dāng)；試驗(yàn)結(jié)果無一致性等。35

斑蝶事件：

1999年5月，康奈爾大學(xué)的一個(gè)研究組在《Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國大斑蝶，導(dǎo)致44％的幼蟲死亡。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在科學(xué)上沒有說服力：玉米的花粉非常重，擴(kuò)散不遠(yuǎn)，在玉米地以外５米，馬利筋葉片/CM2上只找到一個(gè)玉米花粉；2000年開始在美國三個(gè)州和加拿大進(jìn)行的田間試驗(yàn)都證明，抗蟲玉米花粉對斑蝶并不構(gòu)成威脅，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)中用１０倍于田間的花粉量來喂大斑蝶的幼蟲，也沒有發(fā)現(xiàn)對其生長發(fā)育有影響。斑蝶減少的真正原因，一是農(nóng)藥的過度使用，二是墨西哥生態(tài)環(huán)境的破壞。36

加拿大“超級雜草”事件：由于基因漂流，在加拿大油菜地里發(fā)現(xiàn)了個(gè)別油菜植株可以抗一種、兩種或三種除草劑，因而有人稱此為“超級雜草”，并怪罪于轉(zhuǎn)基因?；蚱鞑⒉皇菑霓D(zhuǎn)基因作物開始。如果沒有基因漂流，就不會有進(jìn)化，世界上也就不會有這么多種的植物和現(xiàn)在的作物栽培品種。舉例來說，小麥由Ａ、Ｂ、Ｄ三個(gè)基因組組成，它是由分別帶有Ａ、Ｂ、Ｄ基因組的野生種經(jīng)過基因漂流合成的。所以，以此來禁止轉(zhuǎn)基因作物，也是沒有道理的。37中國Ｂt抗蟲棉破壞環(huán)境事件：

2002年6月3日，南京環(huán)科所與綠色和平組織在北京召開會議，６月４日《Chinadaily》上發(fā)表了題為“GMCottonDamageEnviroment”的文章。當(dāng)天,綠色和平組織在其網(wǎng)站上刊登了南京環(huán)科所、綠色和平組織顧問薛達(dá)元先生長達(dá)26頁的英文報(bào)告，從而再次引發(fā)國際爭論，在歐、美產(chǎn)生巨大反響。６月５日德國《農(nóng)業(yè)報(bào)》發(fā)表了題為“中國研究：Ｂｔ棉破壞環(huán)境巨大”。綠色和平組織的“中國項(xiàng)目主管”聲稱：“棉農(nóng)將面對不受控制的超級害蟲”、“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉不但沒有解決問題，反而制造了更多的問題”、“棉農(nóng)將被迫使用更多、更毒的農(nóng)藥”。事實(shí)上，抗蟲棉在中國實(shí)踐多年，深受廣大棉農(nóng)的歡迎。中國、美國、德國、加拿大、比利時(shí)、印度等國的科學(xué)家已在網(wǎng)上紛紛發(fā)表評論，反駁綠色和平組織的觀點(diǎn)。38爭論的實(shí)質(zhì)

現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因作物的安全性已經(jīng)成了國際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。由于某些媒體的炒作，對消費(fèi)者的心理和轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化已經(jīng)產(chǎn)生了很大的負(fù)面影響。我們的判斷？39我們所要了解的---轉(zhuǎn)基因植物的潛在風(fēng)險(xiǎn):1.轉(zhuǎn)基因植物釋放引發(fā)“超級雜草”目前轉(zhuǎn)入植物的基因以抗除草劑的為多，其次以抗蟲和抗病毒，然后是抗逆。如果這些基因逐漸在野生種群中定居后，就具有選擇優(yōu)勢的潛在可能，成為難以控制的“超級雜草”。402.轉(zhuǎn)基因植物中35S啟動子的生物安全性啟動子是基因表達(dá)所必需的，決定了外源基因表達(dá)空間、表達(dá)時(shí)間和表達(dá)強(qiáng)度等，是人們定向改造生物的重要限制因素。最常用的啟動子是35S啟動子，該啟動子能夠在植物組織中高水平表達(dá)。因此已經(jīng)被引入許多轉(zhuǎn)基因植物中。潛在風(fēng)險(xiǎn)問題:35S啟動子內(nèi)有一重組熱點(diǎn)。（1）如果35S啟動子插入到隱性病毒基因組旁，可能會重新活化病毒。（2）啟動子插入到某一編碼毒素蛋白的基因上游，可能會增強(qiáng)該毒素的合成。（3）當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物被動物或人類食用后，35S啟動子可能會插入到某一致癌基因上游，活化并且導(dǎo)致癌變。413.抗生素抗性標(biāo)記基因的生物安全性抗生素抗性標(biāo)記基因是否導(dǎo)致的在環(huán)境中的傳播。目前，轉(zhuǎn)基因作物都使用細(xì)菌編碼的抗生素抗性基因作為選擇性標(biāo)記。在過去的幾年里，越來越多的報(bào)道指出:細(xì)菌可以獲得對多種抗生素的抗性。這導(dǎo)致人們開始懷疑：轉(zhuǎn)基因植物中的抗性基因是否會轉(zhuǎn)移到細(xì)菌中?？剐詷?biāo)記基因是否會通過食物在腸道中水平轉(zhuǎn)移至體內(nèi)微生物，從而影響抗生素治療的有效性。抗性標(biāo)記基因產(chǎn)物是否使人體產(chǎn)生抗藥性（食品安全性）。424.轉(zhuǎn)基因食品的安全性1994年美國Caigene公司的轉(zhuǎn)基因延熟番茄經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，成為第一例通過安全評價(jià)的轉(zhuǎn)基因植物食品。轉(zhuǎn)基因食品對人類的可能危害主要有3大類：（1）可能含有已知或未知的毒素，對人體產(chǎn)生毒害作用。（2）可能含有已知或未知的過敏源，引起人體的過敏反應(yīng)。（3）食品某些營養(yǎng)成分或營養(yǎng)質(zhì)量可能產(chǎn)生變化，使人體出現(xiàn)某種病癥。43國外對轉(zhuǎn)基因食品管理的現(xiàn)狀

1.國際組織實(shí)質(zhì)等同原則表型性狀的等同成分等同

2000年《卡塔赫納生物安全協(xié)定書》62個(gè)國家簽署

2001年《生物安全議定書》130多個(gè)國家簽署2003年《生物技術(shù)食品的風(fēng)險(xiǎn)評估草案》226個(gè)國家表示歡迎442.美國◆1992年美國公布了轉(zhuǎn)基因作物不需由作市場前評價(jià)，除非它引起新的安全性問題。2000年4月，在國會科學(xué)委員會下屬的基礎(chǔ)研究委員會的調(diào)查報(bào)告中，堅(jiān)持認(rèn)為沒有科學(xué)的證據(jù)之前不能將GMF作為一個(gè)新的食品級別◆2000年1月美國政府對轉(zhuǎn)基因玉米的種植頒布了限令，以防止害蟲對轉(zhuǎn)基因玉米中毒素形成抗藥性。美國環(huán)境保護(hù)局限令美國大部分玉米產(chǎn)區(qū)的農(nóng)場主應(yīng)至少種植20％的傳統(tǒng)玉米，在同時(shí)種植玉米和棉花的地區(qū)，傳統(tǒng)玉米要達(dá)到50％◆2001年7月出臺了《轉(zhuǎn)基因食品管理草案》規(guī)定，來源于植物且被用于人類或動物的GMF在進(jìn)入市場之前至少120天，生物工程制造商必須提出申請，并提供此類食品的相關(guān)資料，以確認(rèn)此類食品與相應(yīng)的傳統(tǒng)產(chǎn)品相比具有等同的安全性453.歐盟◆歐盟對GMF持反對態(tài)度，1998年提出轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全性之后，其反對態(tài)度更加強(qiáng)硬。他們對轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的農(nóng)作物、家畜以及再加工食品加以抵制，尤其對美國的轉(zhuǎn)基因玉米已終止了進(jìn)口，然而對于西班牙和德國的轉(zhuǎn)基因玉米卻沒有采取措施◆歐盟的法律由兩項(xiàng)：歐盟理事會90／220令，于1990年4月頒布實(shí)施，該法令中規(guī)定了轉(zhuǎn)基因生物的批準(zhǔn)程序；1997年5月《新食品法》規(guī)定對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必須加貼標(biāo)簽464.其它國家◆日本、澳大利亞、俄羅斯、加拿大、韓國、泰國、巴西的政策基本與國際組織的相同，但是巴西最近宣布在未查清轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境的影響之前，暫時(shí)停止種植轉(zhuǎn)基因大豆?！舭l(fā)展中國家迫切需要解決糧食問題，對于高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品表示歡迎，這些國家技術(shù)落后，沒有相關(guān)的轉(zhuǎn)基因成分的檢測條件，對于標(biāo)識問題也只能處于被動地位，基本是按國際組織的要求和《生物安全議定書》要求執(zhí)行47我國對轉(zhuǎn)基因食品的對策

◆1993年12月24日，國家科委頒布實(shí)施了《基因工程安全管理辦法》◆1996年7月10日，國家農(nóng)業(yè)部頒布實(shí)施了《農(nóng)業(yè)生物基因工程安全管理實(shí)施辦法》

◆2001年6月6日國務(wù)院頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》

◆2002年4月8日國家衛(wèi)生部頒布了《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》48由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，如轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品本身對人類的毒害作用，轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境的破壞性作用，包括轉(zhuǎn)入的外源基因在環(huán)境中的擴(kuò)散、對物種多樣性的影響等，因此必須從保障人類健康、發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和維護(hù)生態(tài)平衡與社會安全的基礎(chǔ)出發(fā)，提出一系列具有指導(dǎo)意義的對應(yīng)策略和行之有效的具體措施。具體建議如下：

1.加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性研究：在研究與開發(fā)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的同時(shí)，必須加強(qiáng)其安全性防范的長期跟蹤研究。