植物病毒1課件

第四章植物病毒

植物病毒概述病毒(virus)是一種由核酸、蛋白或其復(fù)合體構(gòu)成的，可以增殖、傳染和寄生在其他生物體上的非細(xì)胞形態(tài)分子生物病毒區(qū)別于其它生物的主要特征是：

1.病毒是個體微小的分子寄生物，其結(jié)構(gòu)簡單；

2.專性寄生物，其繁殖需要寄主提供原料和場所。按寄主的性質(zhì)不同，病毒分為寄生植物的植物病毒(Plantvirus)、寄生動物的動物病毒以及寄生細(xì)菌的噬菌體等。植物病毒的危害及作用病毒引起的病害在數(shù)量上占植物病害的第二位。由植物病毒引起的植物病害的植物有：禾本科、茄科、豆科、十字花科和葫蘆科等。在魯西北引起毀滅性的植物病毒病有番茄蕨葉病毒病，花葉病毒病，辣椒花葉病毒病和煙草脈壞死病毒病等。生產(chǎn)上危害較大的植物病毒病害有：煙草花葉病、黃瓜花葉病、馬鈴薯病毒病、玉米矮花葉病等。植物病毒也有可利用的價值，特別在開發(fā)基因工程的載體、轉(zhuǎn)基因植物研究等方面，發(fā)揮了很大的作用。植物病毒學(xué)研究歷史1936年英國科學(xué)家鮑登(Bawden)證明提純的TMV中含有核酸；l939年Kausch通過電子顯微鏡觀察到植物病毒的形態(tài)；1956年Gierrer證明去掉蛋白質(zhì)的RNA起重要侵染和增殖作用；1971年Diener發(fā)現(xiàn)了很小的RNA（250-400bps)稱為類病毒（viroid);1982年發(fā)現(xiàn)僅有蛋白質(zhì)的朊病毒

植物病毒學(xué)研究歷史1981年，A.Lwoff在巴黎舉行的第五屆病毒學(xué)大會上，這一法國病毒研究所所長阿爾．沃夫，認(rèn)為病毒不是生物，他的觀點如下：

生長和分裂獨立進化獨立的生命體原生生物＋＋＋細(xì)胞＋－－線粒體和葉綠體＋－－膜＋－－染色體、原質(zhì)體含核酸－－－病毒－－－綜上所述，認(rèn)為病毒是有機物，而不是生物。第一節(jié)植物病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與組分一、植物病毒的形態(tài)觀察需要電子顯微鏡，度量尺度為納米(nm)。植物病毒的基本形態(tài)為球狀、桿狀和線條狀。球狀病毒的直徑大多在20一35nm，少數(shù)可以達到70-80nm，球狀病毒也稱為多面體病毒或二十面體(icosahedralparticle)病毒。桿狀病毒多為20-80nm×100-250nm，兩端平齊；少數(shù)兩端鈍圓，線狀病毒多為11—13nm×750nm，個別可以達到2000nm以上。還有少數(shù)病毒與以上形態(tài)不同，它們有的看上去是兩個球狀病毒聯(lián)合在一起，被稱為雙聯(lián)病毒(或雙生病毒)；有的像彈頭，被稱為彈狀病毒；還有的呈絲線狀，柔軟不定形。三、植物病毒的組分植物病毒主要成分是核酸和蛋白質(zhì)，核酸在內(nèi)部，外部由蛋白質(zhì)包被，稱為外殼，有的病毒粒體中還含有少量的糖蛋白或脂類。構(gòu)成病毒的成分：核酸5-40%，蛋白質(zhì)60-95%，還有水分和礦物質(zhì)等。

類病毒和擬病毒無蛋白衣殼，無?；匝鍖W(xué)反應(yīng)，真病毒有?；匝宸磻?yīng)。（一）蛋白質(zhì)

一般植物病毒RNA基因組的翻譯產(chǎn)物只有4~7種，最多12種，這些產(chǎn)物包括病毒的衣殼蛋白，復(fù)制酶，運動蛋白、傳播輔助蛋白、蛋白酶等。蛋白多肽鏈經(jīng)過三維折疊形成衣殼的基本結(jié)構(gòu)單位，稱為蛋白質(zhì)亞基，進而形成殼基。殼基是一種形態(tài)單位，主要表現(xiàn)在球形病毒上，多數(shù)殼基形成衣殼。植物病毒衣殼蛋白具有良好的抗原特性，能刺激動物產(chǎn)生抗體，并和抗原發(fā)生反應(yīng)，是血清學(xué)方法鑒定病毒的依據(jù)。2.病毒核酸的比例球形病毒的核酸含量高，占粒體重量的15%-45%，長條形病毒中占5%-6%；而在彈狀病毒中只占1%3.核酸的多分體現(xiàn)象多分體現(xiàn)象為植物病毒所特有，并僅存于正單鏈RNA中，核酸的多分體現(xiàn)象是指病毒的基因組分布在不同的核酸鏈上，分別包裝的不同的病毒粒體中。所以單個病毒粒體不能完成侵染。這種分段的基因組稱多組分基因組；含多組分基因組的病毒稱多分體病毒。正單鏈RNA病毒根據(jù)基因組的分離和侵染必須的狀況又分為單分體病毒TMV、PVX、PVY雙分體病毒：煙草脆裂病毒和蠕傳病毒三分體病毒：CMV，有四條核酸鏈，但包被在三個或四個病毒粒體中。4.衛(wèi)星RNA

在某些多分體病毒中發(fā)現(xiàn)了小分量的RNA其與病毒RNA無同源性，單獨不具有侵染性，要依賴病毒的核酸才能侵染和增殖這種核酸稱為衛(wèi)星RNA（sRNA）,其依賴的病毒稱為輔助病毒；它們包被在同一衣殼內(nèi)，并抑制輔助病毒的復(fù)制，降低其濃度，并改變其致病力，可利用生物防治及基因工程抗病育種。（三）其它組分水分、糖蛋白或脂類、精胺和亞精胺金屬離子第三節(jié)、植物病毒病的癥狀特點

一、外部癥狀(Symptom)：病毒病害在癥狀表現(xiàn)上多為系統(tǒng)發(fā)病，表現(xiàn)為變色、畸形少數(shù)引起壞死、腐爛，萎蔫極少發(fā)生。變色：花葉(mosaic)，黃化(yellow)。壞死(negrosis)：也稱作枯斑反應(yīng)，如TMV侵染心葉煙表現(xiàn)為壞死枯斑，馬鈴薯Ｙ病毒的某些株系侵染煙草可產(chǎn)生脈壞死?；危阂种菩停喊?dwarf)，卷葉(leafroll)，皺葉(rugose)，蕨葉(fernleaf)。刺激型：叢生(rosette)，腫瘤(tumor)。第三節(jié)植物病毒病的癥狀特點

二、病組織的內(nèi)部和細(xì)胞的變化：

1.組織變化：組織壞死：如煙草花葉病毒TMV，它侵染心葉煙引起薄壁組織壞死，有些引起莖部維管束和葉部壞死，煙草花葉病毒侵染大豆引起頂芽和側(cè)枝壞死。一般引起黃化類型的病毒病多是因輸導(dǎo)組織、韌皮部壞死引起。組織增生：病毒侵染后，寄主植物體內(nèi)代謝失調(diào)，產(chǎn)生激素，引起增生。

第三節(jié).植物病毒病的癥狀特點

2.細(xì)胞的變化：花葉和斑駁是由于細(xì)胞內(nèi)葉綠素遭到破壞所致。內(nèi)含體(inclussion)：某些植物被病毒侵染后，在病組織中產(chǎn)生的一種特殊結(jié)構(gòu)，存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，在顯微鏡下可以觀察到。分為不定型內(nèi)含體Ｘ－體和結(jié)晶體。結(jié)晶體：有六角型、長條型、正四面體型等，個別的還有皿狀，無色透明，主要是由病毒粒體和寄主的蛋白質(zhì)有規(guī)則地排列形成。

第三節(jié)植物病毒病的癥狀特點

三、患病植物的生理變化：表現(xiàn)為：①病毒侵染后呼吸強度先上升，后下降。②碳水化合物含量下降。③淀粉在葉部積累引起黃化。④多酚氧化酶和細(xì)胞色素氧化酶的活性增強，使植物細(xì)胞中毒壞死。⑤光合作用下降，破壞了寄主的葉綠素。

⑥植物內(nèi)源激素水平失去平衡，造成畸形。

第三節(jié)植物病毒病的癥狀特點

四.癥狀變化：一種病毒引起的癥狀可因病毒、寄主和環(huán)境三方面的因素而改變。1.病毒本身：①病毒的株系(Strain)：同一種病毒在致病性上也有差異，也稱為病毒的生理小種，為了便于與真菌生理小種的區(qū)別，稱為株系。有強株系(癥狀表現(xiàn)明顯，危害較大)和弱株系(癥狀不太明顯)。如：TMV(弱株系)番茄花葉或斑駁

TMV番茄條斑株系(強株系)壞死，條斑

TMV弱株系侵染煙草引起輕微斑駁，強株系則引起嚴(yán)重花葉。

第三節(jié)植物病毒病的癥狀特點

②交互保護作用(crossprotection)：同一種病毒的弱株系先接種植物后，就可以保護寄主免受病毒強株系的嚴(yán)重傷害，即先侵染的病毒可以保護植物不再受親緣關(guān)系較近的另一種病毒的侵染。

如果兩種病毒無親緣關(guān)系則沒有這種保護作用。

第三節(jié)植物病毒病的癥狀特點

2.寄主因素：①一種病毒在不同寄主上可表現(xiàn)不同癥狀。如：TMV普通煙──全株型花葉癥狀心葉煙──局部性壞死枯斑②潛伏侵染：一種病毒感染某些植物后，可以侵染但不表現(xiàn)癥狀的現(xiàn)象。如：小麥黃矮病毒在除小麥之外的禾本科作物上不表現(xiàn)癥狀。③同一種病毒侵染同種寄主的不同品種上表現(xiàn)不同：

a.抗病品種：產(chǎn)生局部枯斑反應(yīng)。TMV──心葉煙。

b.高抗或免疫品種：病毒侵入后增殖量很少或不能增殖。

c.耐病品種：侵染寄主后可大量繁殖，但表現(xiàn)癥狀很輕微，這與真菌耐病性不同。

第三節(jié)植物病毒病的癥狀特點

3.環(huán)境因素：環(huán)境因素可抑制或改變癥狀的表現(xiàn)。（1）溫度：〉35℃或〈10℃病害癥狀輕微，特別是對于花葉病，如油菜花葉病和TMV。隱癥：已經(jīng)表現(xiàn)病毒病癥狀的植株，由于環(huán)境條件改變，癥狀消失的現(xiàn)象。這種隱癥在條件合適時又可重新表現(xiàn)癥狀。隱癥：條件不同。潛伏侵染：寄主不同。

（2）光照：過強、過弱都會影響癥狀的表現(xiàn)。多數(shù)在光弱時花葉病癥狀容易表現(xiàn)，接種易成功。

二、介體傳播

植物病毒的介體種類很多，主要有昆蟲、螨類、線蟲、真菌、菟絲子等。其中以昆蟲最為重要。日前已知的昆蟲介體約有400多種，其中約200種屬于蚜蟲類，130多種屬于葉蟬類。在傳毒介體中，昆蟲是最主要的介體，其中70%為同翅日的蚜蟲、葉蟬和飛虱，而又以蚜蟲為最主要的介體，大部分昆蟲傳毒的資料來源于蚜蟲傳毒。介體與所傳病毒之間的關(guān)系主要根據(jù)病毒是否在蟲體內(nèi)循環(huán)、是否增殖以及介體持毒時間長短來劃分。病毒經(jīng)口針、消化道進入血液循環(huán)后到達唾液腺，再經(jīng)口針傳播的過程稱為循回，這種病毒與介體的關(guān)系稱為循回型關(guān)系(circulative)，其中的病毒叫做循回型病毒，介體叫做循回型介體。循回型相互關(guān)系中又根據(jù)病毒是否在介體內(nèi)增殖而分為增殖型(propagative)和非增殖型(nonpropagative)。病毒不在介體體內(nèi)循環(huán)的相互關(guān)系稱為非循回型(nonc比ulative)。根據(jù)介體持毒時間的長短可以分為非持久性(nonpersistent)、半持久性(semipersistent)和持久性(persistent)三種相互關(guān)系。非循回型的關(guān)系全是非持久性的。而循回型關(guān)系中又進一步分為半持久性和持久性兩種。3．介體與病毒?；宰R別的可能機制蚜蟲的試探(probe)取食習(xí)性：蚜蟲對寄主或非寄主均有先從表面少量取食嘗試的特性，如合適再刺入輸導(dǎo)組織取食。在試探取食過程中即可完成對非持久性病毒的獲毒或傳播，所以能高效傳播多種病毒，饑餓時促使試探頻率增加故能提高傳毒效率。介體內(nèi)的?；猿侄疚稽c：在介體消化道內(nèi)有一定的持毒位點與所傳病毒有?；P(guān)系。如某些非持久性、半持久性病毒在前消化道中有持毒點，因前消化道也隨著昆蟲蛻皮而更新，故蛻皮后不能傳毒；蚜蟲口針中的持毒位點已經(jīng)得到免疫熒光標(biāo)記的證明輔助因子(Helpercomponent,簡稱HC)在蚜蟲傳播的非持久病毒的寄主細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)有一種由病毒編碼的蛋白與傳毒有關(guān)，如除去它，蚜蟲也就失去傳毒能力。這種輔助因子也被稱為蚜傳因子，最早在馬鈴薯Y病毒侵染的植物中發(fā)現(xiàn)，但輔助因子的作用方式尚未明確。(二)昆蟲介體

1．蚜蟲在蚜蟲介體中，大約有200種蚜蟲可傳播160多種植物病毒，有的蚜蟲只傳播2—3種病毒，有的可以傳播40一50種病毒(如蠶豆蚜和馬鈴薯蚜)，桃蚜甚至可以傳播100種以上的病毒。在這160多種植物病毒中，有的只由一種蚜蟲傳播，有的可由多種蚜蟲傳播，黃瓜花葉病毒甚至可以由75種蚜蟲傳播。蚜蟲傳播植物病毒主要是非持久性關(guān)系,包括馬鈴營Y病毒屬、花椰菜花葉病毒屬、黃瓜花葉病毒屬、苜?；ㄈ~病毒屬等病毒。這些病毒也都很容易用汁液摩擦方法進行傳播。非持久性病毒基本上是存在于薄壁細(xì)胞中，特別是表皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和柵狀組織細(xì)胞內(nèi)，很少含在韌皮組織內(nèi)。

2．葉蟬和飛虱在葉蟬(1eafhopper)亞目(Cicadellidae)大約2000個屬15000種葉蟬中，只有21個屬中的49種是病毒的傳播介體。飛虱雖然有20個科，但僅僅飛虱亞目(Delphacidae)中含有植物病毒介體。介體的寄主主要是禾本科植物，重要的作物病害如水稻矮縮病、小麥叢矮病和玉米粗縮病等。葉蟬和飛虱(Planthopper)傳播的絕大多數(shù)病毒屬于增殖型，包括植物彈狀病毒抖、植物呼腸孤病毒科、細(xì)小病毒屬和玉米細(xì)條病毒屬。葉蟬和飛虱傳播植物病毒有相似的機制，它們不能傳播非持久性的病毒，少數(shù)傳播半持久性病毒，如水稻東格魯病毒。非增殖傳播的病毒較少，主要是葉蟬傳播的幾種雙聯(lián)病毒。其它昆蟲介體還有刺吸式口器的白粉虱、粉階，刮吸式口器的薊馬、咀嚼式口器的甲蟲、蚱蜢等等。(三)土壤中的介體病毒的土傳是一種歷史的提法，現(xiàn)已明確除了TMV可在土壤中存活較久外，土壤本身并不傳毒，主要是土壤中的線蟲或真菌傳播病毒。已經(jīng)知道5個屬38個種的線蟲傳播80種植物病毒或其不同的株系，其中多數(shù)屬于蠕傳病毒屬和煙草脆裂病毒屬的病毒，少數(shù)為由于線蟲在土壤中移動很慢，傳播距離很有限，每年僅僅30一50cm。因此這些病毒的遠(yuǎn)距離傳播主要依靠苗木其它球狀病毒。其中大多數(shù)還可以通過感病野生雜草的帶毒種子傳播。

傳毒真菌主要是壺菌目和根腫菌目真菌，其中油壺菌屬(Olpidium)、多粘菌屬(Polymyxa)、粉痂菌屬(Spongospora)中的5個種能傳播20多種病毒。三、非介體傳播

(一)機械傳播機械傳播(Mechanicaltransmission)也稱為汁液摩擦傳播。田間的接觸或室內(nèi)的摩擦接種均可稱為機械傳播。田間主要為植株間接觸、農(nóng)事操作、農(nóng)機具及修剪工具污染、人和動物活動等造成。機械傳播對某些病毒很重要，如煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)和馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)只有此種傳播方式；如蠕傳病毒屬(Nepovirus)常經(jīng)果樹修剪傳播；有些病毒在某些特殊種植條件下重要，如黃瓜花葉病毒(CMV)在溫室或大棚蔬菜、花卉中易接觸傳播。這類病毒的特點是病毒存在于表皮細(xì)胞、濃度高、穩(wěn)定性強，引起花葉型癥狀的病毒或由蚜蟲、線蟲傳播的病毒較易機械傳播，而引起黃化型癥狀的病毒和存在于韌皮部的病毒難以或不能機械傳播。(二)無性繁殖材料和嫁接傳播由于病毒系統(tǒng)侵染的特點，在植物體內(nèi)除生長點外各部位均可帶毒，在以球莖、塊根、接穗芽為繁殖的作物中特別重要，如馬鈴薯、大蒜、郁金香、蘋果樹等，如母株受侵染則無一幸免。這些無性繁殖材料都可以帶毒，故成為重要的檢疫對象。嫁接是園藝上非常普通的農(nóng)事措施之一，也是證明疑難病原物侵染性的重要方法之一。嫁接可以傳播任何種類的病毒、植物菌原體和類病毒病害。(三)種子和花粉傳播約1／5的病毒可以種傳。種子帶毒的危害主要表現(xiàn)在早期侵染和遠(yuǎn)距離傳播。帶毒種子隨種子調(diào)運會遠(yuǎn)距離運輸傳播，是檢疫的重要對象，如煙草環(huán)斑病毒(TRSV)、菜豆普通花葉病毒(BCMV)均可在豆科種子中存活5年以上。種子還可能成為病毒越冬的場所，如CMV可在多種雜草種子中越冬。

種傳病毒的寄主以豆科、葫蘆科、菊科植物為多，而茄科植物卻很少。病毒種傳的主要特點是：母株早期受侵染，病毒才能侵染花器；病毒進入種胚才能產(chǎn)生帶毒種子，而僅種皮或胚乳帶毒常不能種傳。種子帶毒比例差別很大，如大麥條紋花葉病毒(BSMV)可達90％一100%；黃瓜花葉病毒(CMV)可達1％一50％，一殷不會很高；種傳病毒大多可以機械傳，癥狀常為花葉；如可蚜蟲傳則為非持久件的。隨著種子的逐漸成熟，其種子帶毒率逐漸降低；剛采收的種子帶毒率高，經(jīng)過貯存而逐漸降低。四、病毒在植物體內(nèi)的移動植物病毒自身不具有主動轉(zhuǎn)移的能力，病毒的移動都是被動的。病毒在細(xì)胞間的移動胞間聯(lián)絲是植物細(xì)胞間物質(zhì)運輸?shù)耐ǖ?。病毒的長距離移動大部分植物病毒的長距離移動是通過植物的韌皮部(phloem)，而甲蟲傳播的病毒可以在木質(zhì)部(xylem)移動。在植物輸導(dǎo)組織中，病毒移動的主流方向是與營養(yǎng)主流方向一致的，也可以隨營養(yǎng)進行上、下雙向轉(zhuǎn)移。

TMV在葉片和植株內(nèi)轉(zhuǎn)移的過程，病毒接種在番茄中部復(fù)葉尖端的小葉的側(cè)面，經(jīng)過1~3天，病毒分布到整個小葉；經(jīng)過3~5天病毒則經(jīng)過葉脈、葉柄及莖部的維管束系統(tǒng)到達根部和頂部；25天左右病毒已經(jīng)在全株分布。五、防治植物病毒病的基本原則1.消滅和減少侵染來源

(1)采用無毒種子和無性繁殖材料。

(2)種苗處理，51-53℃溫水中浸10分鐘。

(3)根尖或莖尖的組織脫毒培養(yǎng)。

2.治蟲防病，消滅傳播介體。

3.選育抗病或耐病品種。

4.栽培管理減少人為傳播發(fā)病，煙草打尖打杈時先打健株，再打病株。

第五節(jié)植物病毒的分類與命名植物病毒的分類工作由國際病毒分類委員會(InterrnationalCommitteeonTaxonomyofviruses，ICTV)植物病毒分會負(fù)責(zé)。隨著病毒學(xué)研究水平的提高，新的病毒屬（組）不斷增加，尤其是病毒分類標(biāo)準(zhǔn)、指標(biāo)內(nèi)容越來越明確且接近病毒的本質(zhì)。經(jīng)過20多年的不斷修改、充實，到1995年，ICTV先后發(fā)表《病毒分類與命名》報告六次，在第六次報告中，植物病毒與動物病毒和細(xì)菌病毒一樣實現(xiàn)了按科、屬、種分類。近代病毒分類體系趨于將病毒這類非細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分子寄生物列為獨立的“病毒界”，下分為RNA病毒和DNA病毒兩大類。但為方便及習(xí)慣，仍按寄主種類分為動物病毒、植物病毒、微生物病毒等實用系統(tǒng)分類。一、植物病毒的分類

(一)分類依據(jù)植物病毒分類依據(jù)的是病毒最基本、最重要的性質(zhì)；①構(gòu)成病毒基因組的核酸類型(DNA或RNA)；②核酸是單鏈(singlestrand,ss)還是雙鏈(doublestrand,ds)；②病毒粒體是否存在脂蛋白包膜；④病毒形態(tài)；⑤核酸分段狀況(即多分體現(xiàn)象)等。根據(jù)上述主要特性，將植物病毒分在9個科47個屬中（其中有些屬、種尚未確定），各科(屬)名稱及其典型種見表4~3，各科(屬)形態(tài)及核酸類型見圖4—3,199。病毒類似物在病毒的研究過程中，還相繼發(fā)現(xiàn)了一些與病毒相似、但個體更小、特性稍有差別的病毒類似物。要依賴其它病毒才能存在的小病毒或核酸，稱為衛(wèi)星(satellite)，它們依賴的病毒稱為輔助病毒(heIpervirus)。它們的核酸與輔助病毒很少有同源性，且影響輔助病毒的增殖；其中自身能編碼衣殼蛋白的稱為衛(wèi)星病毒，不能編碼衣殼蛋白的稱為衛(wèi)星核酸。由于植物病毒的衛(wèi)星核酸都是RNA，故稱為衛(wèi)星RNA(satelliteRNA，sRNA)。一些無衣殼蛋白、RNA部分具有雙鏈結(jié)構(gòu)的稱為類病毒(viroid)；含有線狀和環(huán)狀兩種RNA的稱為擬病毒(virusoid)；沒有核酸只有蛋白質(zhì)的侵染因子稱為阮病毒(prion)。為了分類上的方便，將這些病毒都?xì)w入亞病毒(subviruses)，而由核蛋白體構(gòu)成的病毒則稱為真病毒(euviruses)。(三)病毒的株系株系(strain)是病毒種下的變種，具有生產(chǎn)上的重要性。當(dāng)分離到一種病毒，但還未完全了解其特征、不能確定分類地位時，常稱其為“分離物”或“分離株”(isolate)。二、植物病毒的命名植物病毒的名稱目前不采用拉丁文雙名法，仍以寄主英文俗名加上癥狀來命名，如煙草花葉病毒為Tobaccomosaicvirus，縮寫為TMV；黃瓜花葉病毒為Cucumbermosaicvirus，縮寫為CMV。屬名為專用國際名稱，常由典型成員寄主名稱(英文或拉丁文)縮寫十主要特點描述(英文或拉丁文)縮寫十virus拼組而成。如：黃瓜花葉病毒屬的學(xué)名為Cucu—mo—virus；煙草花葉病毒屬為Toba—mo—virus。即植物病毒屬的結(jié)尾是一virus，科、屬名書寫時應(yīng)用斜體，而種和株系的書寫不采用斜體。類病毒(viroid)在命名時遵循相似于病毒的規(guī)則，因縮寫名易與病毒混淆，新命名規(guī)則規(guī)定類病毒的縮寫為Vd，如馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potatospindletuberviroid)縮寫為PSTVd。第六節(jié)植物病毒的鑒定原理植物病毒的分類是將已知病毒按一定標(biāo)淮、相似程度或相關(guān)性的順序排列，拼成一個系統(tǒng)，即分類系統(tǒng)。植物病毒鑒定的主要目的是確定一種病毒在分類系統(tǒng)中的地位，由于植物病毒個體微小，結(jié)構(gòu)簡單，對寄主的依賴性強，鑒定工作難度大，技術(shù)性強，對工作條件的要求高。鑒定植物病毒過去大多采用病毒間生物學(xué)特性的差異，如所致癥狀類型、傳播方式、寄主范圍等；現(xiàn)在則增加了病毒核酸、蛋白分子生物學(xué)、生物化學(xué)等方面的方法。常用的方法有生物學(xué)實驗、血清學(xué)檢測和電子顯微鏡觀察等。一、生物學(xué)實驗生物學(xué)實驗的目的是確定病原的侵染性，用實驗方法證明病毒與病害的直接相關(guān)性。生物學(xué)實驗還可以確定病毒的傳播方式，明確病毒所致病害的癥狀類型和寄主范圍。在分子生物學(xué)技術(shù)尚欠發(fā)展的過去，只有生物學(xué)方法可以區(qū)分在遺傳信息上一個核苷酸或者蛋白質(zhì)中一個氨基酸的變異，因此生物學(xué)實驗是其它實驗方法所不可取代的。生物學(xué)實驗中應(yīng)用最多的是鑒別寄主，即用來鑒別病毒或其株系的具有特定反應(yīng)的植物。凡是病毒侵染后能產(chǎn)生快而穩(wěn)定、并具有特征性癥狀的植物都可作為鑒別寄主。組合使用的幾種或一套鑒別寄主稱為鑒別寄主譜。鑒別寄主譜中一般包括可系統(tǒng)侵柒的寄主、局部侵染的寄主和不受侵染的寄主。如若區(qū)分經(jīng)常出現(xiàn)的黃瓜花葉病毒屬的三個成員，采用表4—4的鑒別寄主。

二、電子顯微鏡技術(shù)

與光學(xué)顯微鏡相比，電子顯微鏡使用光源的波長更短(屬于短波電子流)，因此分辨率也大大提高(9.9×l0-11m，比光學(xué)顯微鏡高千倍以上)。但是電子束的穿透力低，樣品厚度必須在10~100nm之間。所以電鏡觀察需要特殊的載網(wǎng)和支持膜，需要復(fù)雜的制樣和切片過程。病毒觀察最常用的是負(fù)染技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)。所謂負(fù)染，是指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強樣品外圍的電子密度，使樣品顯示負(fù)的反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小。與超薄切片(正染色)技術(shù)相比，負(fù)染不僅快速簡易，而民分辨率高，目前廣泛用于生物大分子、細(xì)菌、原生動物、亞細(xì)胞碎片、分離的細(xì)胞器、蛋白晶體的觀察及免疫學(xué)和細(xì)胞化學(xué)的研究工作中，尤其是病毒的快速鑒定及其結(jié)構(gòu)研究所必不可少的一項技術(shù)。三、血清學(xué)技術(shù)

抗血清制備：利用植物病毒衣殼蛋白的抗原(antigen)特性，可以制備病毒特異性的抗血清(antiserum)。先將純化的植物病毒注射小動物(兔子、小白鼠、雞等)，一定時間后取血，獲得抗血清。血清制備的關(guān)鍵是病毒的純化，純度高的病毒才能獲得特異性強的抗血清。血清反應(yīng)植物病毒與其血清的反應(yīng)有好多種，但依據(jù)的原理都是抗原與抗體的特異性結(jié)合。最常用的兩種方法是瓊脂雙擴散和酶聯(lián)免疫吸附測定法。瓊脂雙擴散法：在一定濃度的瓊脂凝膠中，抗體和抗原互相擴散，在適當(dāng)?shù)奈恢眯纬沙恋?；沉淀線的形狀說明抗原和抗體的相互關(guān)系。如圖4—12：(1)說明兩種抗原相同，都與已知的抗血清反應(yīng)；(2)說明兩種抗原有一定的親緣關(guān)系，但不完全相同；(3)說明抗血清不?；袃煞N以上的抗體。酶聯(lián)免疫吸附(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)法：該方法利用了酶的放大作用，使免疫檢測的靈敏度大大提高。與其它檢測方法相比較，ELISA有突出的優(yōu)點：一是靈敏度高，檢測濃度可達1-10ng／m1;二是快速，結(jié)果可在幾個小時內(nèi)得到；三?；詮?，重復(fù)性好；四是檢測對象廣，可用于粗汁液或提純液，對完整的和降解的病毒粒體都可檢測，一般不受抗原形態(tài)的影響；五是適用于處理大批樣品，所用基本儀器簡單，試劑價格較低,且可較長期保存。具有自動化及試劑盒的發(fā)展?jié)摿?。ELISA是實現(xiàn)“快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟”檢測的最好手段之一〔圖4—l3

四、核酸雜交及PCR技術(shù)

血清學(xué)技術(shù)利用的是病毒衣殼蛋白的抗原性，檢測的目標(biāo)是蛋白。由于核酸才是有侵染性的，僅僅檢測到蛋白并不能肯定病毒有無生物活性。因此，核酸檢測技術(shù)也是鑒定植物病毒的更可靠方法，主要有核酸雜交和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法比較常用。核酸雜交主要在DNA和RNA之間進行，依據(jù)是RNA與互補的DNA之間存在著堿基的互補關(guān)系。在一定的條件下，RNA--DNA形成異質(zhì)雙鏈的過程稱為雜交。其中預(yù)先分離純化或合成的已知核酸序列片段叫做雜交探針(Probe)，由于大多數(shù)植物病毒的核酸是RNA，其探針為互補DNA(complementaryDNA，cDNA)，也稱為cDNA探針。核酸檢測不僅可以檢測到目標(biāo)病毒的核酸，而且還可以檢測出相近病毒(或核酸)間的同源程度。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是在短時間內(nèi)大量擴增核酸的有效方法，用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。從已知序列合成兩段寡聚核苷酸作為反應(yīng)的引物，它們分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補且位于待擴增DNA區(qū)段的兩側(cè)。反應(yīng)時，首先在過量的兩種引物及4種dNTP參與下對模板DNA進行加熱變性。隨之將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度使引物與其靶序列發(fā)生退火。此后退火引物在耐熱的洲A聚合酶作用下得以延伸。如此反復(fù)進行變性、退火和DNA合成這一循環(huán)。每完成一個循環(huán)，理論上就使目的DNA產(chǎn)物增加1倍，在正常反應(yīng)條件下，經(jīng)25—30個循環(huán)擴增倍數(shù)可達百萬。

PCR擴增在檢測標(biāo)本中病原的核酸序列、由少量RNA生成cDNA文庫、生成大量DNA以進行序列測定、突變的分析等方向已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。五、物理化學(xué)等特性在植物病毒研究的過程中，人們發(fā)現(xiàn)不同的病毒對外界條件的穩(wěn)定性不同，這便成為區(qū)別不同病毒的依據(jù)之一。隨著新病毒種類的發(fā)現(xiàn)和分子生物學(xué)研究的深入，人們也逐漸認(rèn)識到這些物理特性在區(qū)分不同病毒中的局限性。1．稀釋限點(DilutionEndPoint，DEP)保持病毒侵染力的最高稀釋度，用10-1，10-2，10-3……表示，它反映了病毒的體外穩(wěn)定性和侵染能力，也象征著病毒濃度的高低。2．鈍化溫度(ThermalInactivationPoint,TIP)處理十分鐘使病毒喪失活性的最低溫用攝氏溫度表示。TIP最低的病毒是番茄斑萎病毒，只有有45℃；最高的是煙草花葉病毒，為97℃；而大多數(shù)植物病毒在55—70℃之間；3．體外存活期(Longevityinvitro，LIV)在室溫(20~22℃)下，病毒抽提液保持浸染力的最長時間。大多數(shù)病毒的存活期在數(shù)天到數(shù)月。4．沉降系數(shù)及分子量沉降系數(shù)S是指一種物質(zhì)在20℃水中在1達因(1／981g)的引力場中沉降的速度，單位是每秒若干厘米，因這一單位太大，多采用其千分之一，即Svedberg單位。植物病毒的S20ω常在50S到數(shù)千S之間。沉降系數(shù)的測定要用超速分析離心機，根據(jù)該病毒在一定離心力下沉降的速度來計算。有了沉降系數(shù)還可以來計算分子量。

5．光譜吸收特性由于蛋白質(zhì)和核酸都能吸收紫外線，蛋白質(zhì)的吸收高峰在280nm左右，核酸在260nm左右。因此260／280的比值可以表示病毒核酸含量的多少，用于區(qū)分不同的病毒，比值小的多是線條病毒，比值高可能是球狀病毒；對同一種純化的病毒，紫外吸收值可以表示病毒的濃度，對未純化的病毒其260／280比值偏離標(biāo)準(zhǔn)值的情況，說明病毒的純度.文獻中常有E0.1%1cm260nm值,表示該病毒在0．1％濃度，光徑為1cm比色杯中在260nm處的吸收值。

6．植物病毒的化學(xué)特性主要是指核酸的類型、核酸的鏈數(shù)以及核酸的分子量、核酸在病毒粒體中的百分含量等。病毒核酸的這些特性用在病毒的分科、分屬之中。

表4-4黃瓜花葉病毒屬三種病毒

在鑒別寄主植物上的癥狀反應(yīng)

鑒別寄主 黃瓜花葉病毒 花生矮化病毒番茄不孕病毒

花生無病癥褪綠，矮花葉無癥狀菊花不侵染？侵染黃瓜花葉花葉無花葉

第六節(jié)重要的植物病毒屬及典型種

一、煙草花葉病毒屬及TMV二、黃瓜花葉病毒和CMV三、馬鈴薯Y病毒屬及PVY一、煙草花葉病毒屬及TMV煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)具有13個種和2個可能種，典型種為煙草花葉病毒(TMV)。病毒形態(tài)為直桿狀，直徑18nm，長300nm煙草花葉病毒屬中大多數(shù)病毒的寄主范圍較廣，屬于世界性分布；自然傳播不需要介體生物，靠植株間的接觸傳播；對外界環(huán)境的抵抗力強。體外存活期一般在幾個月以上。在干燥的葉片中可以存活50多年；稀釋限點為l0-4一10-7，鈍化溫度90℃左右。引起的花葉病是煙草、番茄等作物上的重要病害，發(fā)生普遍嚴(yán)重。TMV主要靠病汁液接觸傳播，在農(nóng)事操作中沾染了病株汁液的手或工具通過接觸煙苗的微傷口侵入。由于病毒的抗逆力很強，混有病株殘體的肥料、種子、土壤和帶病的其它寄主植物及野生植物，甚至烤過的煙葉、煙末都可以成為病害的初侵染來源。二、黃瓜花葉病毒和CMV黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)有3個成員，即黃瓜花葉病毒(CMV)、番茄不孕病毒(ToAV)和花生矮化病毒(PnSV)。典型種是黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)：粒體球狀，直徑28nm。CMV在自然界主要依賴多種蚜蟲為傳毒媒介，以非持久性方式傳播，也可經(jīng)汁液接觸而機械傳播，也有少數(shù)報道可由土壤帶毒而傳播。黃瓜花葉病毒的寄主十分廣泛，天然寄主有67個科470種植物