酶促動力學-生物化學實驗課件

生物化學與分子生物學實驗特點：獨立性，廣泛應用性。幾種常用生物大分子制備技術光譜技術、層析技術、電泳技術、離心技術放射性同位素技術分子克隆、外源基因表達、分子雜交要求：實驗報告書寫實驗目的：原理：操作：結(jié)果：分析/討論：注意事項：

實驗七酶促反應動力學實驗

酶促反應動力學

概念：酶促反應動力學：研究酶促反應速度及其影響因素。反應速度：單位時間內(nèi)底物減少或產(chǎn)物增加的速度，常用初速度來衡量。產(chǎn)物0時間初速度酶促反應速度逐漸降低酶促反應的時間進展曲線影響酶促反應速度的因素：底物濃度[S]酶濃度[E]反應溫度pH值抑制劑激活劑中間產(chǎn)物學說

E+SESE+Pk1k2k3一、底物濃度對酶促反應速度的影響米---曼氏方程

（Michaelis-Mentenequation）V=Vmax[S]Km+[S]米-曼氏方程解釋：當[S]Km時，v=(Vmax/Km)[S],即v正比于[S]當[S]Km時，vVmax,即[S]而v不變[S]vKmVm2v=（Vm/Km）[S]v=Vm=K3[E]底物濃度對酶促反應速度的影響V=Vmax[S]Km+[S]矩形雙曲線：Km值與Vmax值測定雙倒數(shù)作圖法又稱林-貝氏作圖法（1934）1=

Km

1+1VVmax[S]Vmax1/V-1/Km01/[S]斜率=Km/Vmax1/Vmax二、酶濃度對酶促反應速度的影響酶的最適pH:酶催化活性最高時的pH。2810pH酶的活性

pH對某些酶活性的影響A:胃蛋白酶;B:葡萄糖-6-磷酸酶三、pH對酶促反應速度的影響AB一些酶的最適pH值酶最適pH胃蛋白酶1.8過氧化氫酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.8四、溫度對酶促反應速度的影響五、抑制劑對酶促反應速度的影響抑制作用:直接或間接地影響酶的活性中心,使酶活性降低或喪失。抑制劑：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)?？赡嬉种?reversibleinhibition)

抑制劑與酶以非共價鍵疏松結(jié)合引起酶活性的降低活喪失,結(jié)合是可逆的,能夠通過透析、超濾等物理方法使酶恢復活性?？赡嬉种祁愋停焊偁幮砸种?competitiveinhibition)非競爭性抑制（non-competitiveinhibition）反競爭性抑制（uncompetitiveinhibition）(一)競爭性抑制(competitiveinhibition)

概念競爭性抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)相似，與底物競爭同一種酶的活性中心,從而影響E與S的結(jié)合。SSEEIIEE+P無I有I

競爭性抑制的底物濃度曲線v競爭性抑制作用過程[S]競爭性抑制的特點：I與S分子結(jié)構(gòu)相似；Vmax不變，表觀Km增大；抑制程度取決于I與E的親和力，以及[I]和[S]的相對濃度比例。（二）非競爭性抑制（non-competitiveinhibition）

概念

抑制劑與酶分子活性中心以外的其它部位結(jié)合而抑制酶活性，I和S與酶結(jié)合不存在競爭關系。非競爭性抑制作用過程：

SSEEEE+PSESIIII思考題：1、概念：酶、酶活性、反應初速度、酶活性中心、必需基團、Km、最適溫度、最適pH、競爭性抑制、2、比較競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制作用特點及林-貝氏圖；簡述競爭性抑制的理論和實際意義?？赡嫘砸种谱饔玫膭恿W比較作用特點無抑制劑競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制與I結(jié)合組分動力學參數(shù)表觀Km表觀Vm雙倒數(shù)作圖斜率縱軸截距橫軸截距KmVmKm/Vm1/Vm-1/KmEKm(1+[I]/Ki)VmKm(1+[I]/Ki)/Vm1/Vm1/Km(1+[I]/Ki)E、ESKmVm/(1+[I]/Ki)Km(1+[I]/Ki)/Vm(1+[I]/Ki)/Vm-1/KmESKm/(1+[I]/Ki)Vm/(1+[I]/Ki)Km/Vm(1+[I]/Ki)/Vm-(1+[I]/Ki)/Km酶的分類1、氧化還原酶（oxidoreductase）2、轉(zhuǎn)移酶（transferase）3、水解酶（hydrolase）4、裂解酶（或裂合酶lyase）5、異構(gòu)酶（isomerase）6、合成酶（synthease）或連接酶（ligase）1.加入酶液立即計時，迅速混勻置37℃水浴15min。注意：酶促反應開始，從加入酶液起計時至下一步加入堿性溶液停止反應，各管反應時間應準確一致，均為15分鐘。2.保溫后各管立即加入0.5MNaOH溶液1.0ml，快速混勻，防止局部濃度過高。3.各管混勻之后再分別加入0.3%4-AA1.0ml及0.5%K3Fe（CN）62.0ml，混旋儀充分振蕩混勻，使顯色完全。室溫放置10min后以6號管校正零點，在分光光度計中比色(λ=510nm)注意：必須立即混勻，否則顯色不完全。

注：表1～表3中，基質(zhì)液即底物液（磷酸苯二鈉）

表1表2以下操作同表1步聚中1、2、3、步

表3