染色體與DNA分子生物學

染色體與DNA分子生物學第1頁/共71頁2.1.1染色體概述染色體(chromosome)是細胞核中載有遺傳信息的物質，在顯微鏡下呈絲狀或棒狀，由核酸和蛋白質組成，在細胞發(fā)生有絲分裂時期容易被堿性染料著色，因此而得名。染色體包括DNA和蛋白兩大部分。同一物種內每條染色體所帶DNA的量是一定的，但不同染色體或不同物種之間變化很大，從上百萬到幾億個核苷酸不等。組成染色體的蛋白質（組蛋白和非組蛋白）種類和含量也是十分穩(wěn)定的。第2頁/共71頁人類22對常染色體及1對性染色體顯微結構圖1.28億個核苷酸對，1465個基因0.19億個核苷酸對，210個基因第3頁/共71頁除外觀結構不同之外，在細胞內的存在方式也不同：原核細胞染色體外裹著稀疏的蛋白質，其中一部分與DNA的折疊有關，另一些則參與DNA復制、重組及轉錄過程。真核細胞的染色體中，DNA與蛋白質完全融合在一起，其蛋白質與相應DNA的質量比約為2:1.染色體位于真核細胞的核仁內，極細微的線性構造，生命之線。染色體只有在細胞有絲分裂過程中，才可在光學顯微鏡下觀察到，分裂間期則以較細且松散的染色質形式存在。端粒—生命時鐘第4頁/共71頁染色體特征：分子結構相對穩(wěn)定；能夠自我復制，使親、子代之間保持連續(xù)性；指導蛋白質的合成，控制整個生命過程；產(chǎn)生可遺傳的變異。真核細胞DNA的轉錄和翻譯在不同的空間和時間上進行，其基因表達的調控不僅與DNA序列有關，也與染色體的結構有關。2.1.2真核細胞染色體的組成第5頁/共71頁1.蛋白質包括組蛋白和非組蛋白。組蛋白是染色體的結構蛋白，它與DNA組成核小體。組成：DNA，組蛋白，非組蛋白，RNA富含賴氨酸和精氨酸，H3、H4富含精氨酸，H1富含賴氨酸，H2A、H2B介于之間。第6頁/共71頁組蛋白的特性1.進化上的極端保守性。不同種生物組蛋白的氨基酸組成十分相似。特別是H3、H4，牛、豬、大鼠的H4完全相同。2.無組織特異性。

僅發(fā)現(xiàn)兩個例外（鳥魚兩棲紅細胞H1-H5，精細胞魚精蛋白）3.肽鏈上氨基酸分布的不對稱性。

N端堿性氨基酸C端疏水氨基酸4.組蛋白的修飾作用

甲基化、乙酰化、磷酸化、多聚ADP糖基化等，修飾作用只發(fā)生在細胞周期的特定時間和組蛋白的特定位點上。

5.富含賴氨酸的組蛋白H5。

只存在于鳥類、兩棲類等含有細胞核的紅細胞中。與H1并無明顯的親緣關系。第7頁/共71頁非組蛋白包括酶類、細胞分裂有關的蛋白（收縮蛋白、骨架蛋白、核孔復合物蛋白）、肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白、原肌蛋白等。高速泳動蛋白（highmobilitygroupprotein,HMG蛋白）能與DNA結合，也能與H1作用，可能與超螺旋結構有關。DNA結合蛋白可能是一些與DNA復制或轉錄有關的酶或調解物質。A24非組蛋白C端與H2A相同，功能不詳?shù)?頁/共71頁2.真核生物基因組DNA特點：含有大量的重復序列；功能DNA序列大多被非功能DNA隔開。C值(Cvalue)：一種生物單倍體基因組DNA的總量。真核生物中，C值一般隨生物進化而增加。C值反?，F(xiàn)象(C-valueparadox)：C值往往與種系進化的復雜程度不一致。各種生物細胞內DNA總量比較第9頁/共71頁不重復序列一個或幾個拷貝，占DNA總量的40-80%，序列長約750-2000bp.

結構基因基本上屬于不重復序列。單拷貝基因也可以合成大量蛋白：蠶絲心蛋白DNA-104mRNA-109protein中度重復序列重復次數(shù)10-104，占DNA總量的10-40%，編碼rRNA、tRNA和某些結構蛋白。中度重復序列往往分散在不重復序列之間。

高度重復序列衛(wèi)星DNA(satelliteDNA)，只在真核生物中發(fā)現(xiàn)，占基因組的10-60%，由6-100個堿基組成。高度濃縮，異染色質的組成部分。大多位于染色體著絲粒。不轉錄，功能不明，可能與染色體的穩(wěn)定性有關。真核細胞核酸序列大致可被分為3類：第10頁/共71頁核小體——染色體DNA的一級包裝染色質螺線管(30nmfiber)——二級包裝染色質纖維環(huán)—三級包裝

3.染色質和核小體第11頁/共71頁染色質和核小體染色質DNA的Tm值比自由DNA高。

Tm值的概念：DNA的熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結構降解一半時的溫度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比。染色質DNA的復制和轉錄活性比自由DNA低。DNA酶I對染色質DNA的消化慢于純DNA。由DNA和組蛋白組成的染色質纖維細絲是許多核小體連成的念珠狀結構。第12頁/共71頁染色質的電子顯微鏡圖和X線衍射圖微球菌核酸酶（Micrococcalnuclease）處理染色質后電泳，被保留的DNA片段均為200bp基本單位的倍數(shù)。第13頁/共71頁核小體單體被微球菌核酸酶處理后，隨著時間延長，其降解產(chǎn)物(DNA片段)會逐漸縮短，從200bp降至146bp，至此很難再進一步降解。這種穩(wěn)定結構為核心顆粒，它是由146bp的DNA片段和H2A、H2B、H3和H4各2分子組成。第14頁/共71頁第15頁/共71頁核小體是一種串珠狀結構，由核心顆粒和連結線DNA兩部分組成，可描述如下：①每個核小體單位包括約200bp的DNA、一個組蛋白核心和一個H1；②由H2A、H2B、H3、H4各兩分子形成八聚體，構成核心顆粒；③DNA分子以左手螺旋纏繞在核心顆粒表面，每圈80bp，共1.75圈，約146bp，兩端被H1鎖合；④相鄰核心顆粒之間為一段60bp的連接線DNA。核小體的形成是染色體中DNA壓縮的第一步，收縮至原尺寸的1/7.第16頁/共71頁Twoquestions:DNA復制過程中是否從核心顆粒上解離下來，復制完再組裝上去？還是在核小體上復制？DNA纏繞在核心顆粒上為何不掉落？第17頁/共71頁染色質螺線管(30nmfiber)在較高離子強度下，并保留H1，電鏡可觀察到10nm纖維會折轉成較粗的30nm纖維，這就是染色體DNA的二級包裝——螺線管纖維(solenoidalfiber)。螺線管纖維(的形成使DNA一級包裝又壓縮了6倍。是分裂間期染色質和分裂中期染色體的基本組分。第18頁/共71頁螺線管纖維相隔一定間距的某些區(qū)段被"拉攏"固定在蛋白軸上，從而產(chǎn)生了許多從骨架上伸出的纖維環(huán)(loops)。第19頁/共71頁螺線管纖維纏繞在非組蛋白構成的中心軸(centralaxis)骨架（支架蛋白質）上形成染色質纖維環(huán)。染色質纖維環(huán)是在螺線管纖維基礎上的更高一級包裝。從螺線管纖維環(huán)到包裝形成染色體是DNA壓縮程度最高的階段，估計在200~240倍。纖維環(huán)的形成是基因表達較理想的結構，這些環(huán)狀區(qū)是基因表達的活性單位所在。因為纖維環(huán)DNA比其它區(qū)域有更伸展的結構。第20頁/共71頁染色體(chromosome)的形成染色質濃縮時，纖維環(huán)會再繞成直徑600nm的螺旋。若用染料染色，即呈現(xiàn)觀察到的染色體。這種更高層次上的組裝機理，目前尚無明確定論。第21頁/共71頁第22頁/共71頁過程成分名稱寬度增加長度壓縮第一級DNA+組蛋白核小體5倍7倍第二級核小體螺線管3倍6倍第三級螺線管超螺旋13倍40倍第四級超螺旋染色體2.5-5倍5倍合計500-1000倍8400倍（8000-10000）染色體形成過程中長度與寬度的變化第23頁/共71頁真核生物基因組的結構特點基因組龐大存在大量重復序列大部分為非編碼序列（>90%）真核生物與細菌、病毒最主要區(qū)別轉錄產(chǎn)物為單順反子真核基因是斷裂基因，有內含子存在大量順式作用元件（啟動子、增強子、沉默子）存在大量的DNA多態(tài)性有端粒結構決定啟動子的轉錄效率

RNA聚合酶Ⅱ識別序列對mRNA加尾有重要作用終止子，轉錄終止的信號第24頁/共71頁2.1.3原核生物基因組

原核生物的基因組都較小，DNA與少量蛋白（非組蛋白）結合構成染色體，染色質中無組蛋白。原核細胞有一條環(huán)狀的染色體（現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了有些原核細胞含多條染色體，或線性染色體，或二者皆有）；質粒（plasmid）DNA第25頁/共71頁質粒DNA:染色體外的DNA分子，其大小范圍在1kb至200kb以上不等，以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。

質粒主要發(fā)現(xiàn)于細菌、放線菌和真菌細胞中，大多數(shù)質粒的宿主范圍較窄，復制和轉錄或多或少依賴于宿主編碼的酶和蛋白質。質粒攜帶的一些基因賦予宿主某些特殊的表型，其中不少具有重要的醫(yī)學和商業(yè)價值。由質粒產(chǎn)生的表型包括對抗生素的抗性，產(chǎn)生抗生素、大腸桿菌素、腸毒素、限制性酶與修飾性酶，以及降解復雜有機化合物等。基因工程中質粒常被用作基因的載體。第26頁/共71頁第27頁/共71頁E.coli的基因組幾乎全部由基因構成。E.coli的單條染色體上大多數(shù)DNA都編碼蛋白質或RNA，非編碼序列也都參與調控基因轉錄。原核細胞基因組DNA的特點：1結構簡練

絕大部分編碼蛋白質第28頁/共71頁2.存在轉錄單元功能相關的基因往往集中在一起，它們可被一起轉錄成多順反子mRNA。第29頁/共71頁3.有重疊基因閱讀框改變或不改變即同一段DNA能攜帶兩種不同蛋白質的信息。

一個基因完全在另一個基因里；B-AE-D

部分重疊；K-C

兩個基因只有一個堿基對重疊。D-J第30頁/共71頁2.2DNA的結構第31頁/共71頁2.2.1DNA一級結構（PrimaryStructure）DNA的一級結構是指組成DNA分子的脫氧核苷酸的連接方式和排列順序。

DNA是由很多個dAMP、dGMP、dCMP和dTMP通過3’,5’-磷酸二酯鍵連成的無分支雙鏈線狀或環(huán)狀多核苷酸。由于核苷酸之間的差異僅僅是堿基的不同，故可稱為堿基順序第32頁/共71頁DNA（脫氧核糖核酸deoxyribonucleicacid）的組成成分：核糖和脫氧核糖嘌呤(purine)嘧啶(pyrimidine)第33頁/共71頁第34頁/共71頁許許多多個脫氧核苷酸或核苷酸經(jīng)3’-5’磷酸二酯鍵聚合而成為DNA或RNA鏈第35頁/共71頁所謂DNA的一級結構，就是指4種核苷酸的連接及排列順序，表示了該DNA分子的化學構成。核苷酸序列對DNA高級結構的形成有很大影響DNA是巨大的生物高分子，如人的DNA就包含了3x10９堿基對，如此數(shù)目的堿基可容納巨大的信息量。生物界里的遺傳信息都包含在組成DNA的A、G、C、T這四種核苷酸的排列順序之中。第36頁/共71頁DNA的方向是5’-3’（蛋白質是N-C）DNA通常以線性或環(huán)狀形式存在DNA通常是雙鏈的(dsDNA)，少數(shù)是單鏈的(ssDNA)DNA的一級結構是指4種核苷酸的排列順序。GC豐富區(qū)易形成左手螺旋反向重復的片段易形成發(fā)夾結構一級結構對高級結構的影響：延伸：5‘TCTCTCTCTCTCTAGAGAGAGAGAGA’3

3‘AGAGAGAGAGAGATCTCTCTCTCTCT’55‘NNNGAAGGTCCNNNNGGACCTTCNNN’3

3‘NNNCTTGCAGGNNNNCCTGGAAGNNN’5反向重復序列（invertedrepeatsequence）回文結構（Palindrome）NNNN

CGCGTAGCGCATATGCNNNNNN第37頁/共71頁核酸一級結構可用簡寫式表示；核酸分子簡寫式表示的中心含義即是核酸分子中的核苷酸（或堿基）排列順序。

第38頁/共71頁線條式:

在堿基符號書寫基礎上，以垂線（位于堿基之下）和斜線（位于垂線與P之間）分別表示糖基和磷酸酯鍵。第39頁/共71頁字符式：用A、T、G、C、U代表堿基，用P代表磷酸殘基。核酸分子中的糖基、糖苷鍵和酯鍵等均省略不寫，將堿基和磷酸相間排列即可。不再注解“脫氧”與否，簡寫式中出現(xiàn)T的為DNA鏈，出現(xiàn)U則為RNA鏈。以5‘和3’表示鏈的末端及方向，分別置于簡寫式的左右二端。5’pApCpTpTpGpApApCpG3’

DNA5’pApCpUpUpGpApApCpC3’RNA第40頁/共71頁簡化為：5’pACTTGAACG3’DNA5’pACUUGAACG3’RNA簡寫式的5‘-末端均含有一個磷酸殘基（與糖基的C-5’位上的羥基相連），3‘-末端含有一個自由羥基（與糖基的C-3’位相連）；若5‘端不寫P，則表示5’-末端為自由羥基。雙鏈DNA分子的簡寫式多采用省略了磷酸殘基的寫法，在上述簡式的基礎上再增加一條互補鏈（complementarystrand)即可。

5’GGAATCTCAT3’3’CCTTAGAGTA5’第41頁/共71頁DNA分子中不同排列順序的DNA區(qū)段構成特定的功能單位，這就是基因，不同基因的功能各異，各自分布在DNA的一定區(qū)域?；虻墓δ苋Q于DNA的一級結構，要解釋基因的生物學含義，就必須弄清DNA順序。因此，DNA序列測定是分子遺傳學中一項既重要又基本的課題。第42頁/共71頁DNA不僅具有嚴格的化學組成，還具有特殊的空間結構，主要以有規(guī)則的雙螺旋形式存在。2.2.2DNA的二級結構DNA雙螺旋的基本特點：由兩條互相平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成；脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側，構成基本骨架，堿基排列在內側；兩條鏈上的堿基通過氫鍵結合，按一定規(guī)律形成堿基對---堿基互補配對原則。第43頁/共71頁DNA的二級結構是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋結構。生物活體中，二級結構和高級結構都是時刻變化的，即在二級結構的各種構象間、二級結構與高級結構間或高級結構的各種構象間存在動力學平衡。第44頁/共71頁B-DNA的反向平行雙螺旋結構結構參數(shù)：螺旋直徑2nm；螺旋周期包含10bp；螺距3.4nm；相鄰堿基對平面的間距0.34nm。第45頁/共71頁第46頁/共71頁右手螺旋：A-DNA,B-DNA左手螺旋：Z-DNA第47頁/共71頁B構象：生物體內天然存在的DNA幾乎都以B-DNA存在。A構象：是在以鈉、鉀或銫作為反向離子時，將DNA纖維在75%相對濕度下進行X光衍射測定出來的。DNA-RNA雜交分子、RNA-RNA雙鏈結構均為A構象。對基因表達有重要意義。Z構象：在DNA進行轉錄或其他一些生理過程中會產(chǎn)生Z-DNA結構，之后DNA會放出能量，形成B-DNA。

螺距殘基數(shù)堿基傾斜

A型(75%,Na)2.81120°B型(92%,Na)3.4100°C型(66%,Li)3.19.36°D/Rhybrid2.81120°Z型4.6129°第48頁/共71頁左手螺旋Z-DNA是右手螺旋結構模型的補充和發(fā)展。B-DNA是最常見的DNA構象，A-DNA和Z-DNA具有不同的生物活性。第49頁/共71頁Z-DNA的生物學意義Z-DNA的形成通常在熱力學上是不利的。因為Z-DNA中帶負電荷的磷酸根距離太近了，這會產(chǎn)生靜電排斥。但DNA鏈的局部不穩(wěn)定區(qū)的存在就成為潛在的解鏈位點。DNA解螺旋卻是DNA復制和轉錄等過程中必要的環(huán)節(jié)，因此認為這一結構位點與基因調節(jié)有關。可能提供某些調節(jié)蛋白的識別位點。Z-DNA與B-DNA連接處的結構，韓國人發(fā)表在2005年10月20日《nature》上。第50頁/共71頁DNA雙鏈的變性和復性當DNA溶液溫度接近沸點或者PH較高時，互補的兩條鏈就可能分開，稱為DNA的變性（denaturation).可逆的。應用于現(xiàn)代分子生物學研究。增色效應減色效應第51頁/共71頁Tm值吸光度增加到最大值一般時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或熔點（meltingpoint）。

DNA中G+C的含量。Tm=69.3+0.41(G+C)%<25merTm=4(G+C)+2(A+T)溶液中的離子強度。DNA一般在含鹽緩沖液中比較穩(wěn)定。DNA的均一性。第52頁/共71頁2.2.3DNA的高級結構超螺旋是雙螺旋DNA進一步扭曲盤繞形成的三級結構。第53頁/共71頁(1)超螺旋(superhelixorsupercoil)的發(fā)現(xiàn)1965年電鏡發(fā)現(xiàn)SV40和多瘤病毒的環(huán)形DNA的超螺旋；第54頁/共71頁

絕大多數(shù)原核生物DNA都是共價封閉環(huán)(covalentlyclosedcircleDNA,cccDNA)分子，雙螺旋環(huán)狀分子螺旋化成為超螺旋結構。第55頁/共71頁有些單鏈環(huán)形染色體(如φ×174)或雙鏈線形染色體(如噬菌體)，在其生活周期的某一階段，染色體也變?yōu)槌菪Y構。真核生物的染色體多為線形分子，但DNA均與蛋白質相結合，同樣具有超螺旋形式。第56頁/共71頁(2)超螺旋的形成DNA雙螺旋結構中，一般每轉一圈有10個核苷酸對，平時，雙螺旋總處于能量最低狀態(tài)。若正常DNA雙螺旋額外地多轉或少轉幾圈，使每一圈的核苷酸數(shù)目大于或小于10，就會出現(xiàn)雙螺旋空間結構的改變，在DNA分子中產(chǎn)生額外張力。若此時雙螺旋的末端是固定的或是環(huán)狀分子，雙鏈不能自由轉動，額外的張力不能釋放，導致DNA分子造成扭曲，形成超螺旋。第57頁/共71頁負超螺旋：形成超螺旋時，旋轉方向與DNA雙螺旋方向相反，旋轉結果使DNA分子內部張力減小，稱為松旋效應。在自然條件下共價封閉環(huán)狀DNA呈負超螺旋結構。正超螺旋：與負超螺旋相反，形成超螺旋時的旋轉方向與DNA雙螺旋方向相同，結果加大了DNA分子內部張力，有緊旋效應。正超螺旋右旋負超螺旋左旋第58頁/共71頁第59頁/共71頁第60頁/共71頁連環(huán)數(shù)（linkingnumber):指在雙螺旋DNA中，使兩條鏈完全分開時一條鏈必須穿過另一條鏈的次數(shù)，以Lk表示；是共價閉環(huán)DNA（cccDNA）的固有拓撲特性。在不發(fā)生鏈斷裂時其值為常數(shù)，是環(huán)狀DNA的一個很重要特性；L是整數(shù)，右手螺旋對L取正值。扭轉數(shù)（twistingnumber):指DNA分子中的WatsonCrick螺旋數(shù)，即一條鏈纏繞另一條鏈的次數(shù)，以Tw表示。Tw為變量，可以是非整數(shù)，右手螺旋時T為正值。纏繞數(shù)（writhingnumber)或超螺旋數(shù)，以Wr表示。Wr為變量，可以是非整數(shù)。第61頁/共71頁如果一個cccDNA分子處在一個平面上，在這種平面構象中，其連環(huán)數(shù)（Lk）等于扭轉數(shù)（Tw）；但cccDNA分子通常不是處在一個平面上，它容易發(fā)生扭轉變形，形成超螺旋；在不破壞共價鍵的條件下，部分扭轉數(shù)轉變?yōu)槔p繞數(shù)；而扭轉數(shù)與纏繞數(shù)之和（即連環(huán)數(shù)）是不變的，即：Lk=Tw+Wr第62頁/共71頁連環(huán)差ΔLk=Lk-Lk0，可以反映超螺旋的程度

Lk0指在生理條件下松弛時cccDNA的連環(huán)數(shù)

ΔLk絕對值遠大于零，DNA會因過度扭曲產(chǎn)生超螺旋；

ΔLk＞0，產(chǎn)生正超螺旋；

ΔLk＜