核酸的物化性質(zhì)

核酸的物化性質(zhì)第1頁/共42頁一、核酸的水解核酸分子中的N-糖苷鍵和磷酸酯鍵都可被水解。（一）核酸的酸解糖苷鍵和磷酸酯鍵都能被酸水解，水解的難易順序為：磷酸酯鍵>糖苷鍵嘧啶堿的糖苷鍵>嘌呤堿的糖苷鍵嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵最易水解。如，DNA在pH1.6于37℃對水透析即可完全除去嘌呤堿，。嘧啶糖苷鍵的水解常需要較高的溫度。用甲酸（98％-100%）密封加熱至175℃2h，無論RNA或DNA都可以完全水解，產(chǎn)生嘌呤和嘧啶堿。第2頁/共42頁（二）核酸的堿解常用的堿有NaOH、KOH等，主要水解磷酸酯鍵。以KOH效果最好。RNA較易被堿水解。例如，在0.3-1mol/LNaOH溶液中，在室溫至370C條件下RNA幾乎可以完全水解，生成2′-或3′-核苷酸，還可能有少量的核苷、2′,5′-或3′,5′-核苷二磷酸。DNA在較難被堿水解。DNA在1mol/LNaOH溶液中，加溫至1000C，4個小時也可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。這種水解性能上的差別，與RNA核糖基上2′-OH參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時，2′-OH首先進攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。第3頁/共42頁第4頁/共42頁（三）核酸的酶解核糖核酸酶T2（RNaseT2）。這個酶的來源同RNaseT1，主要作用點為Ap殘基，可以將tRNA完全降解成3′-腺苷酸結(jié)尾的寡核苷酸。第5頁/共42頁牛脾核糖核酸酶的作用位點核糖核酸酶T1的作用位點第6頁/共42頁

鏈球菌脫氧核糖核酸酶，是一個內(nèi)切酶，作用于DNA產(chǎn)物為5′-磷酸為末端的碎片，其長度不一。限制性內(nèi)切酶，在細菌中發(fā)現(xiàn)有這類酶，主要是降解外源的DNA。具有很嚴格的堿基序列專一性，是基因工程最重要的工具酶。第7頁/共42頁第8頁/共42頁第9頁/共42頁三、核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm之間有強吸收峰，在260nm左右有最大吸收峰?？梢宰鳛楹怂峒捌浣M分定性和定量測定的依據(jù)。對于純的DNA或RNA，可測定A260雙螺旋DNA含量（μg/mL）=A26050單鏈DNA含量（μg/mL）=A26040

寡核苷酸含量（μg/mL）=A26020

純度的判斷：測定A260/A280的比值，純DNA比值>1.8純RNA比值≥2.0第10頁/共42頁有時核酸溶液的紫外吸收以摩爾磷的吸光度來表示，摩爾磷即相當于摩爾核苷酸。據(jù)此先測定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩爾磷吸光系數(shù)ε（P）。增色效應——當雙鏈核酸變性轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂満怂釙r，其在260nm的紫外吸收值增加，ε（P）值也升高，這種現(xiàn)象稱為增色效應。減色效應——當單鏈核酸復性轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈核酸時，其在260nm的紫外吸收值減少，ε（P）值也降低，這種現(xiàn)象稱為減色效應。第11頁/共42頁四．核酸的變性、復性與雜交（一）核酸的變性（denaturation）核酸的變性——指核酸雙螺旋區(qū)的堿基之間的氫鍵斷裂，變成單鏈的過程。能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的變性。RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒有DNA那樣明顯。利用紫外吸收的變化，可以檢測核酸變性的情況。因為天然狀態(tài)的DNA在完全變性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%.而RNA變性后，約增加1.1%。第12頁/共42頁A260值增加粘度下降浮力密度增大分子量不變DNA變性后的表現(xiàn)第13頁/共42頁DNA的熱變性和解鏈溫度（Tm）用加熱的方法使核酸變性叫做熱變性。DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，通常把加熱變性使DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為DNA熔解溫度或熔點，用Tm表示。一般DNA的Tm值在82-95C之間。RNA的Tm值tRNA的Tm值第14頁/共42頁DNATm的影響因素：（1）DNA的均一性。均質(zhì)DNA，如一些病毒DNA，人工合成的poly(A-T)、poly(G-C)的熔解過程發(fā)生在一個較小的溫度范圍內(nèi)；異質(zhì)DNA的熔解過程發(fā)生在一個較寬的溫度范圍內(nèi)。Tm大小可反映出DNA的均一性。第15頁/共42頁（2）G-C的含量。G-C的含量高，Tm值高。因而測定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通過經(jīng)驗公式計算：

（G+C)%=(Tm-69.3)2.44第16頁/共42頁（3）介質(zhì)中的離子強度。Tm與介質(zhì)中離子強度有關(guān)，一般來說，在離子強度低的介質(zhì)中，DNA的Tm值較低，熔解的范圍較寬。在離子強度高的介質(zhì)中，DNA的Tm值較高，熔解的范圍較窄。DNA的保存應在含鹽的緩沖液中第17頁/共42頁RNA的變性第18頁/共42頁（二）核酸的復性變性DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復性。DNA復性后，一系列物理、化學性質(zhì)將得到恢復。DNA復性的程度、速率與復性過程的條件有關(guān)。將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復性，這一過程也叫退火（annealing)。分子量越大復性越難。濃度越大，復性越容易。此外，DNA的復性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。復性反應的速度用Cot1/2表示。Co為變性DNA復性時的濃度，t為時間，以秒表示。第19頁/共42頁DNA復性第20頁/共42頁（三）核酸的雜交（hybridization）熱變性的DNA單鏈，在復性時并不一定與同源DNA互補鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。DNA單鏈與互補的RNA鏈之間也可以發(fā)生雜交。核酸的雜交在分子生物學和遺傳學的研究中具有重要意義。第21頁/共42頁第22頁/共42頁第23頁/共42頁第24頁/共42頁第25頁/共42頁Southernblotting(Southern印跡)Northernblotting(Northern印跡)Westernblotting(Western印跡)第26頁/共42頁第15章核酸的研究方法一、核酸的分離、提純和定量（一）DNA的分離1、染色體DNA與堿性蛋白（組蛋白）結(jié)合成的核蛋白（DNP）沉淀真核細胞破碎1mol/L氯化鈉提取稀釋至0.14mol/L加水飽和的苯酚，振蕩冷凍離心水相（含DNA）酚相（含蛋白質(zhì)）加2倍體積冷乙醇純DNA第27頁/共42頁2、用氯仿-辛醇（或異戊醇）代替苯酚，方法同165℃保溫4h真核細胞懸液加入2倍體積含1%SDS的緩沖液和廣譜蛋白酶加苯酚抽提分離水相（含DNA和少量RNA）酚相（含蛋白質(zhì)和酶）加RNA酶純DNA3、4、氯化銫密度梯度離心第28頁/共42頁（二）第29頁/共42頁（三）第30頁/共42頁第31頁/