核醫(yī)學(xué)其它體外分析分子核進(jìn)展

核醫(yī)學(xué)其它體外分析分子核進(jìn)展第1頁/共28頁含意：除RIA之外的一切體外放射分析，但它的應(yīng)用有一定局限性。一、競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合分析（CPBA）：待分析物的結(jié)合劑：蛋白質(zhì)舉例：TBG甲狀腺素結(jié)合球蛋白→甲狀腺素

CBG皮質(zhì)醇結(jié)合球pro→皮質(zhì)醇

SHBG性激素結(jié)合球pro→皮質(zhì)醇內(nèi)因子結(jié)合蛋白→B12

視蛋白→視黃醛蛋白激酶→CAMP、cGMP

牛乳蛋白酶、葉酸還原酶→葉酸第2頁/共28頁方法：競(jìng)爭(zhēng)性與RIA相同優(yōu)點(diǎn)：這些蛋白天然存在，來源豐富，制備簡(jiǎn)單，省時(shí)，方法學(xué)成熟易建立。缺點(diǎn)：①比抗體的特異性差、靈敏度也差，為了提高特異性，須在樣品制備上下功夫。如純化，清除干擾物等，不夠方便。②該類蛋白種類有限，應(yīng)用范圍受限，已有很多被RIA和IRMA取代。

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二、放射受體分析RRARRA與RBA的區(qū)別含義：以受體為結(jié)合劑，利用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理對(duì)配體進(jìn)行體外分析。受體的分類：

膜R：一般為水溶性配體（肽類激素、兒茶酚胺等）胞內(nèi)R：（漿or核），一般為脂溶性的配體（甲狀腺素，類固醇）受體樣品的制備：與RBA相同。

第4頁/共28頁標(biāo)記品的要求：要求配體標(biāo)記前后生物活性不受影響。因?yàn)闃?biāo)記配體在RRA時(shí)活性往往是降低的。如125I標(biāo)上一個(gè)不影響，如果有二個(gè)125I標(biāo)上就有變化了。RRA的優(yōu)點(diǎn)：

1、R與L的結(jié)合反應(yīng)快、瞬間完成、比RIA出結(jié)果快。

2、能反應(yīng)L的生物學(xué)活性。如冬眠靈有多種衍生物，它們均能與特異抗體結(jié)合，但只有有生物活性的衍生物才能與受體結(jié)合，這種測(cè)定反應(yīng)L的生物學(xué)活性，而不是免疫活性。所以研究物質(zhì)結(jié)合與功能RRA占有相當(dāng)?shù)牡匚弧５?頁/共28頁RRA的缺點(diǎn)：

1、靈敏度比RIA小10—100倍，這是因?yàn)椴煌M織間得來的受體對(duì)配體的親和力有差異，又難以尋找高親和力的受體。

2、反應(yīng)條件和環(huán)境嚴(yán)格，離子強(qiáng)度，溫度、PH值要求高。

3、NSB結(jié)合容量大，親和力又小，NSB較大第6頁/共28頁臨床應(yīng)用：

1、利用受體來測(cè)體內(nèi)配體的含量。

2、測(cè)定體內(nèi)抗受體抗體的量。有些疾病發(fā)現(xiàn)體內(nèi)存在著抗R的抗體（自身抗體），如Gtrave’sdisease(TSH、甲狀腺素R的抗體)；InsulinB型抗癥（InsR-Ab）、重癥肌無力（乙酰膽鹼受體抗體）。這類受體的抗體有兩類特征：

1、受體結(jié)合部位抗體（R—Ab）：當(dāng)R與Ab成復(fù)合物時(shí)，復(fù)合物中的R可再與配體結(jié)合，即R的結(jié)合位點(diǎn)保留，但復(fù)合物卻抑制配體與單獨(dú)存在的游離R相結(jié)合。

2、受體非結(jié)合部位抗體（Ab）：它的特征是復(fù)合物對(duì)配體與R的結(jié)合無抑制作用。

第7頁/共28頁三、酶的放射分析（REA）1、酶的活性（力）分析概念：酶活性（力）：指酶催化加速反應(yīng)的能力。表示法：濃度/時(shí)間（反應(yīng)酶促反應(yīng)速度的快慢）酶的反應(yīng)速度，可以是底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量單位：Kat：（催量）指在規(guī)定條件下，每秒鐘酶催化1mol底物轉(zhuǎn)變所需要酶的量。舊單位：U；1U=16.67kat

符號(hào)：底物用S表示，S*指標(biāo)記的底物酶用E表示P產(chǎn)物反應(yīng)式：*S+EE*SE*P*P+E

經(jīng)過一般時(shí)間，從反應(yīng)液中分離出*P，測(cè)放。第8頁/共28頁*P的CPS酶活性（力）的計(jì)算（kat）=---------------------SA·t·e*P的CPS酶的比活力（kat/g）=---------------------SA·t·e·w可知以下幾個(gè)量：t（分）：*P的放射性CPS；SA標(biāo)記物的比活度；e儀器效率；W參加反應(yīng)的酶的蛋白量（mg）。

第9頁/共28頁優(yōu)點(diǎn):1、靈敏度高（放射性標(biāo)記品）2、特性性強(qiáng)，由酶的專一性決定。3、適用廣，絕大多數(shù)酶可用此法。缺點(diǎn):1、需高質(zhì)量的定位標(biāo)記物2、分離方法復(fù)雜，難以自動(dòng)化。酶液制備：標(biāo)記物制備與選擇PH、激活或抑制劑的使用、溫度、時(shí)間等（自學(xué)）第10頁/共28頁2、酶促同位素衍生物分析：實(shí)際上分析底物含量。反應(yīng)：標(biāo)記試劑+待測(cè)底物

標(biāo)記衍生物E舉例：32P—rATP+膽鹼[32P]一磷酰膽鹼+ADP激酶膽鹼

衍生物的放射性強(qiáng)弱標(biāo)記試劑比活度可計(jì)算待測(cè)物量（底物）注意：需要知道一個(gè)分子待測(cè)物能與標(biāo)記試劑結(jié)合的分子比。如果用雙同位素標(biāo)記可以更準(zhǔn)確。

第11頁/共28頁3、酶的激動(dòng)劑和抑制劑測(cè)定法：原理：激動(dòng)或抑制劑可加快或減慢酶促反應(yīng)的速率，用系列濃度的激動(dòng)或抑制劑與酶進(jìn)行定時(shí)反應(yīng)，分離產(chǎn)物測(cè)放射性，可計(jì)算出激動(dòng)劑或抑制劑的量。如磷酸吡哆醛能使酪氨酸脫羧基產(chǎn)生Co2，14C標(biāo)記酪氨酸經(jīng)磷酸吡哆醛作用產(chǎn)生14Co2，可計(jì)算磷酸吡哆醛的量。第12頁/共28頁4、放射酶促飽和分析法：與酶的底物分析相同

該法類同RIA的競(jìng)爭(zhēng)，不同之處是E不斷從E*S和ES中釋放出來而再去與S反應(yīng)，如果反應(yīng)時(shí)間足夠長(zhǎng)，因*S與S為同一物，會(huì)均被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，失去競(jìng)爭(zhēng)之間的函數(shù)關(guān)系，所以不能象RIA那樣等待反應(yīng)平衡，而應(yīng)該在一定時(shí)間就得分離測(cè)定。這是它的關(guān)鍵（特點(diǎn)之一）

5，

ELISA：固相酶標(biāo)記-免疫分析待測(cè)抗原固相化，然后與酶標(biāo)記的抗體結(jié)合形成復(fù)合物，最后不測(cè)放射性而是讓酶顯色計(jì)算物質(zhì)含量。第13頁/共28頁6、整體酶活力測(cè)定及應(yīng)用二氧化碳呼氣試驗(yàn)：用14C或13C等標(biāo)記酶的底物，如經(jīng)過酶的作用，其產(chǎn)物中可收集到CO2等，反映酶活力。應(yīng)用：幽門螺桿菌可產(chǎn)生尿素酶。如果胃內(nèi)有幽門螺桿菌，可將14C標(biāo)記的尿素分解為14CO2。因此有了呼氣14CO2。檢測(cè)幽菌的檢驗(yàn)。第14頁/共28頁7、其它體外分析的新進(jìn)展

①化學(xué)發(fā)光分析（CLIA）：如發(fā)光劑魯米諾經(jīng)氧化劑H2O2和催化劑（HRP）作用下放出光子（發(fā)光）特點(diǎn)：a、用發(fā)光物質(zhì)代替放素建立的免疫分析。b、試劑盒穩(wěn)定性更好，發(fā)光物用特殊處理后才發(fā)光。c、無放射性污染d、設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單（仍昂貴，但RIA也貴）e、發(fā)光效率與溫度有關(guān)，須配備恒溫設(shè)備f、臨床上可應(yīng)用項(xiàng)目有限，價(jià)格高于RIA第15頁/共28頁②時(shí)間分辨熒光免疫分析（TrFIA）

概念：稀土元素：稀土元素不是土,是周期表中57—71號(hào)元素的總稱，現(xiàn)又新發(fā)現(xiàn)二個(gè)鈧、釔，共計(jì)17個(gè)元素。如果用稀土元素標(biāo)記化合物，而這些稀土元素如Eu（銪）、Tb（鋱）Te、Sm（釤）、Dy（鏑）等可發(fā)射熒光，在紫外線激發(fā)下其發(fā)光能譜和發(fā)光時(shí)間相對(duì)集中而穩(wěn)定。而干擾因素的本底發(fā)光壽命很短，可將標(biāo)記物放置短時(shí)間，待本底光暴光后再去測(cè)量稀土熒光，所以叫時(shí)間分辨。必要時(shí)其發(fā)光還可做些增效處理。第16頁/共28頁該方法優(yōu)點(diǎn)：1、靈敏度高，特異性強(qiáng)2、出結(jié)果快3、樣品熒光能重現(xiàn)4、無放射性污染缺點(diǎn)：儀器價(jià)格貴配套試劑制備困難第17頁/共28頁③免疫PCR原理：用DNA做標(biāo)記物，用PCR法擴(kuò)增產(chǎn)物上的DNA，通量測(cè)定DNA的量進(jìn)行定性研究?；痉磻?yīng)：1）將待測(cè)物抗原固化試管底部2）加入生物素標(biāo)記的特異抗體Ab-b3）加入親和素A做為連接分子

Ag+Ab-b+A→Ag—Ab-b-A4）再加入生物素標(biāo)記的DNA-b得Ag—Ab-b-A-b-DNA

引物PCR擴(kuò)增→染色記錄PCR擴(kuò)增的DNA量確定Ab的含量。第18頁/共28頁優(yōu)點(diǎn)：1）特異性強(qiáng)（與RIA相同）2）靈敏度高（比酶標(biāo)高1000倍，也高于RIA）3）操作簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：1）假陽性高2）影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度的因素多3）未商品化第19頁/共28頁還有化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）p209

用鹼性磷酸酶標(biāo)記Ab，反應(yīng)的復(fù)合物帶有酶，加入底物金剛烷（dioxetanephosphate）后酶促底物斷裂而發(fā)光。電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECL）p209

第20頁/共28頁8、活化分析：

基本原理，用粒子束（射線）照射樣品，使其中待測(cè)穩(wěn)定核素發(fā)生核反應(yīng)變?yōu)榉潘?，由于這些放素各具有一定的半衰期、固定的能量特征r射線或其它射線，測(cè)量其衰變出的射線能量和活度就可確定樣品中各元素的種類和活度。臨床應(yīng)用：微量元素分析第21頁/共28頁活化分析的類型：1）中活化分析：a、反應(yīng)堆中子活化分析（廣泛）b、中子高壓倍加器（啟動(dòng)費(fèi)用高）c、中子源，如Ra-Be中子源（Ra的a粒子轟擊Be可產(chǎn)生中子）d、自發(fā)裂變中子源252Cf（價(jià)格貴），將239Pu在反應(yīng)堆照射二年吸收13個(gè)中子才能得到252Cf產(chǎn)額很低。2）帶電粒子活化分析：一般將帶電子粒子如P、d、a加速，然后轟擊待測(cè)元素，產(chǎn)生新的放素或穩(wěn)定核素。如12C（p,r）13N3）r射線活化分析：較危險(xiǎn)，目前很少用。第22頁/共28頁活化分析的優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高10-9克左右②沒有試劑污染③可進(jìn)行非破壞性分析④一次可同時(shí)分析幾十種元素缺點(diǎn)：①精確度低②有干擾反應(yīng)（副反應(yīng)）③方法不易普及④不能測(cè)化合物的量和結(jié)構(gòu)。第23頁/共28頁最常用的計(jì)算公式（相對(duì)測(cè)量法）

WXAX----------=-----------WSAS第24頁/共28頁8、質(zhì)子激發(fā)X線發(fā)射分析PIXEA

原理：用高速運(yùn)動(dòng)的質(zhì)子轟擊待測(cè)元素，待測(cè)元素原子核外電子被擊出，留下的空穴將被外層電子來填補(bǔ)，多余的能量以特征X線放出。特征（產(chǎn)生射線的能量與入射粒子無關(guān)，它只與被測(cè)元素的種類有關(guān)。不同的元素產(chǎn)生不同的特征X線。第25頁/共28頁分子核醫(yī)學(xué)進(jìn)展內(nèi)涵：利用示蹤技術(shù)觀察體內(nèi)的生化過程并與相關(guān)基因聯(lián)系起來的一門分支學(xué)科，分子識(shí)別是其重要理論基礎(chǔ)。研究領(lǐng)域：受體顯像基因顯像