未知病原菌的分離鑒定

未知病原菌的分離鑒定第1頁/共35頁未知病原菌的分離鑒定

第2頁/共35頁病原菌檢測程序藥物敏感試驗標(biāo)本直接涂片、染色、鏡檢分離、鑒定生化試驗(書p17-18)血清學(xué)試驗(玻片凝集法)動物試驗(產(chǎn)毒性、分離)初步診斷分子生物學(xué)技術(shù)(核酸雜交、PCR、基因芯片核酸)

其他檢測技術(shù)觀察培養(yǎng)特征、形態(tài)特征病原菌抗原檢測形態(tài)結(jié)構(gòu)第3頁/共35頁臨床標(biāo)本中未知病原性球菌的分離鑒定程序

臨床標(biāo)本直接涂片、革蘭染色、鏡檢(形態(tài),排列,染色性)血瓊脂平板/巧克力血瓊脂平板(菌落性狀,溶血性,色素)可疑菌落

涂片,染色,鏡檢

純培養(yǎng)

生化反應(yīng)

致病性測定

藥敏試驗

思考：如何從膿拭子、咽拭子中分離并鑒定病原性球菌？第4頁/共35頁查病原標(biāo)本膿血便、肛拭子選擇/鑒別培基生化反應(yīng)血清學(xué)鑒定雙糖發(fā)酵,橘櫞酸鹽利用試驗,尿素,靛基質(zhì)試驗……玻片凝集試驗SS平板,中國蘭,EMB未知腸道桿菌的分離鑒定程序

第5頁/共35頁伊紅美藍(lán)平板---

EMBEosin-methyleneblueagar,EMB第6頁/共35頁克氏雙糖鐵試驗Doublesugarironslant第7頁/共35頁枸櫞酸鹽利用試驗Citrateslant第8頁/共35頁吲哚試驗Indolebroth第9頁/共35頁玻片凝集第10頁/共35頁一、材料：5人/組1.待檢標(biāo)本：

膿拭子、咽拭子、尿液標(biāo)本、肛拭子1#、肛拭子2#

2.培養(yǎng)基：血平板 3塊/組

EMB平板 3塊/組克氏雙糖鐵斜面 3支/組 動力-靛基質(zhì)-尿素半固體 3支/組3.其他：革蘭染液、玻片、10%膽鹽、靛基質(zhì)試劑、NS、兔血漿、

3%H2O2、沙門氏菌多價血清、志賀氏菌多價血清

二、方法(實驗程序)三、結(jié)果四、討論設(shè)計性實驗

臨床標(biāo)本中病原菌的分離與鑒定第11頁/共35頁實驗?zāi)康氖煜づR床標(biāo)本中常見病原菌的分離鑒定程序?qū)W習(xí)膿汁、痰、糞便、尿液等臨床標(biāo)本的檢查方法實驗要求針對病例，對臨床標(biāo)本中的病原菌進(jìn)行分離和鑒定實驗前制定方案，實驗后寫出實驗報告實驗分組5人/組1套標(biāo)本/組（膿汁、痰、尿液、糞便）進(jìn)程安排實驗分3次進(jìn)行第12頁/共35頁實驗材料膿汁標(biāo)本：膿拭子培養(yǎng)基：血瓊脂平板其他：3%H2O2、兔血漿、生理鹽水、革蘭染液、玻片等第13頁/共35頁膿拭子

分離培養(yǎng)（血平板）革蘭染色革蘭染色觸酶實驗血漿凝固酶實驗實驗方案第1次課第2次課第14頁/共35頁實驗操作與觀察觸酶實驗+-觸酶實驗：挑取菌落置玻片上；滴加1～2滴3%H2O2，觀察結(jié)果；第15頁/共35頁實驗操作與結(jié)果血漿凝固酶實驗+-凝固酶實驗：取生理鹽水于玻片上，挑取待檢菌置于生理鹽水中，制成菌懸液，觀察有無自凝現(xiàn)象。向菌懸液中加1滴兔血漿并混合，觀察結(jié)果。第16頁/共35頁實驗材料痰標(biāo)本：咽拭子培養(yǎng)基：血瓊脂平板其他：生理鹽水、10%膽鹽、Optochin紙片、革蘭染液、玻片等第17頁/共35頁咽拭子革蘭染色革蘭染色莢膜染色膽汁溶菌實驗奧普托辛實驗

分離培養(yǎng)（血平板）實驗方案第1次第2次第3次觀察奧普托辛實驗結(jié)果第18頁/共35頁實驗操作奧普托辛實驗：挑取菌落涂于血平板上，將optochin紙片貼于接種處；37℃培養(yǎng)18～24小時，觀察結(jié)果。第19頁/共35頁膽汁溶菌實驗（平板法）：在血平板上標(biāo)記單個菌落直接在菌落上加一接種環(huán)去氧膽酸納溶液將平板37℃孵育20～30分鐘，觀察結(jié)果實驗操作第20頁/共35頁莢膜染色：石炭酸復(fù)紅單染

1.涂片、自然干燥、火焰固定；

2.1滴石炭酸復(fù)紅，立即沖去，鏡下觀察。實驗操作第21頁/共35頁實驗材料尿標(biāo)本：尿液培養(yǎng)基：EMB平板克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基動力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基其他：革蘭染液、靛基質(zhì)試劑、玻片等第22頁/共35頁尿液

離心沉淀1500轉(zhuǎn)，10分鐘

分離培養(yǎng)（EMB平板）革蘭染色革蘭染色克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基動力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基觀察結(jié)果觀察結(jié)果完成靛基質(zhì)試驗實驗方案第1次第2次第3次第23頁/共35頁實驗材料糞便標(biāo)本：肛拭子（1#、2#）培養(yǎng)基：EMB平板克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基動力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基其他：生理鹽水、靛基質(zhì)試劑、沙門菌多價血清、志賀菌多價血清、玻片等第24頁/共35頁肛門拭子1、2EMB平板克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基動力-靛基質(zhì)-尿素半固體瓊脂培養(yǎng)基觀察結(jié)果觀察結(jié)果完成靛基質(zhì)試驗玻片凝集試驗實驗方案第1次第2次第3次第25頁/共35頁討論內(nèi)容針對實驗步驟的討論；對結(jié)果的分析；還需要進(jìn)一步做哪些實驗；此次實驗成功或需要改進(jìn)的地方；其他預(yù)習(xí)：肥達(dá)反應(yīng)第26頁/共35頁實驗報告

臨床標(biāo)本中病原菌的分離與鑒定

班級________

組別_________

姓名_________

學(xué)號_________

日期________

材料

1.待檢標(biāo)本：

2.培養(yǎng)基：

3.其他：

方法

結(jié)果

討論（包括對結(jié)果的分析、結(jié)論以及尚需追加實驗等）

第27頁/共35頁肥達(dá)試驗(Widaltest)

用已知的傷寒沙門菌O、H抗原、甲型副傷寒沙門菌、肖氏、希氏沙門菌H抗原的診斷菌液，與患者血清作定量凝集試驗，檢測患者血清中的相應(yīng)抗體，輔助診斷傷寒、副傷寒。GeorgesWidalin1896(French)第28頁/共35頁Widaltest正常值：診斷傷寒：O凝集效價>1:80,H凝集效價>1:160;

診斷副傷寒：O凝集效價>1:80,H凝集效價>1:80

才有診斷價值.動態(tài)觀察：抗體效價隨病程延長而上升；雙份血清升高4倍或以上；O與H抗體的診斷意義：

O↑，H↑---腸熱癥(傷寒或副傷寒)的可能性大

O↓，H↓---患病的可能性小

O不高，H↑---預(yù)防接種/非特異性回憶反應(yīng)

O↑，H不高---感染早期或與傷寒沙門菌O抗原有交叉反應(yīng)的其他沙門菌感染少數(shù)病例在整個病程中，肥達(dá)試驗始終呈“-”:

早期使用抗生素治療或患者免疫功能低下第29頁/共35頁Widaltest

(5人/組)材料：病人未知血清：1#，2#，3#菌液：O、H、PAH、PBH（已知Ag）方法：每組1塊多孔板/24支試管；每人2支吸管；第30頁/共35頁

棄0.5ml于消毒缸

12345 6 NS 0.50.50.50.50.50.5ml

未知血清(1:10)0.50.50.50.50.5

菌液(搖勻) 0.5 0.50.50.50.50.5ml(4種,1種/人)

1:401:801:1601:3201:640(陰性對照)

37℃，水浴過夜（完成一個完整的檢驗）方法第31頁/共35頁

TOTHTAHTBHTCH意義

1:640

1:320

1:6401:320

1:640

1:160

1:640

1:160

肥達(dá)反應(yīng)結(jié)果舉例:發(fā)病早期不久前患過傷寒/菌苗接種/非特異回憶傷寒副傷寒甲肖氏副傷寒第32頁/共35頁“O”抗原凝集現(xiàn)象：（呈顆粒狀薄膜）100％凝集：“＋＋＋＋”：上層清亮，底部完全凝集，呈顆粒狀薄膜（有卷邊）。75％凝集：“＋＋＋”：上層不太清亮，底部凝集明顯。50％凝集：“＋＋”：上層混濁，下層凝集。孔底中央中間約50％白色沉淀，周圍膜狀凝集，約50％。25％凝集：“＋”：液體比較混濁，膜狀凝集少。0％凝集：“－”：如第6孔，混懸后，混濁均勻，底部無凝集。第33頁/共35頁“H”抗原