堿性磷酸酯酶的提取

本文格式為Word版，下載可任意編輯——堿性磷酸酯酶的提取試驗(yàn)一、酸性磷酸酯酶的提取

一、目的

把握胞內(nèi)酶的分開(kāi)提取方法，學(xué)會(huì)離心機(jī)的使用。二、原理

酸性磷酸酯酶(AcidPhosphatase，EC3．1．3．2)存在于植物的種籽、霉菌、肝臟和人體的前列腺之中，能專一性地水解磷酸單酯鍵。本試驗(yàn)選用綠豆芽的酸性磷酸酯酶為材料，磷酸苯二鈉為底物。磷酸苯二鈉經(jīng)過(guò)酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和無(wú)機(jī)磷，其反應(yīng)式如下：

由上式可見(jiàn)，當(dāng)有足量的底物磷酸苯二鈉存在時(shí)，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的產(chǎn)物酚和無(wú)機(jī)磷也越多。根據(jù)酶活力單位的定義，在酶促反應(yīng)的最適條件下每分鐘生成1微摩爾(μmo1)產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)活力單位，因此可用Folin一酚法測(cè)定產(chǎn)物酚或用定磷法測(cè)定無(wú)機(jī)磷來(lái)表示酸性磷酸酯酶的活力。本試驗(yàn)采用的是Folin-酚法。試驗(yàn)前將綠豆芽細(xì)胞破碎，釋放出酸性磷酸酯酶，離心除去細(xì)胞碎片和植物纖維等雜質(zhì)，得到酸性磷酸酯酶的粗酶溶液，為下面的酶學(xué)性質(zhì)研究及SDS電泳法測(cè)分子量等系列生物化學(xué)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。三、試驗(yàn)器材

1．LGl0—2.4A高速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)，1臺(tái)／組2．托盤天平：1臺(tái)／組。3．滴管：1支／組。

4．100mL燒杯：2只／組。5．100mL三角燒瓶：1只／組。6．漏斗：1只／組。7．紗布：若干。8．濾紙：若干。9．碾缽：1套／組。10．培養(yǎng)皿：1個(gè)／組。11．100mL量筒：1支／組。12．塑料手套：多雙／組。13．記號(hào)筆：公用。

14．綠豆芽：當(dāng)日采摘，50克／組。四、操作

1．勻漿：戴上手套，將綠豆芽掐去根和葉得綠豆芽莖，稱取50g的綠豆芽莖，在碾缽中用碾錘完全搗碎，室溫靜置0.5h，在培養(yǎng)皿中用雙層紗布擠濾，得到濾液。

2．平衡：將2只100mL燒杯分別放到托盤天平的2只托盤上進(jìn)行平衡。將濾液倒人2支離心管中，再把離心管連同其蓋子分別放入托盤上的2只燒杯中，用滴管增、減離心管中的溶液使其在托盤天平上進(jìn)行平衡，平衡后蓋上離心管的蓋子，用記號(hào)筆做好標(biāo)記。

3．離心：按住離心機(jī)右側(cè)面上方的按鈕，即可掀開(kāi)離心機(jī)的蓋子，再旋開(kāi)轉(zhuǎn)子的蓋子，將平衡好的2支離心管插入離心機(jī)轉(zhuǎn)子的2個(gè)相對(duì)的槽中(這是為了保護(hù)離心機(jī))，等2組或

3組同學(xué)都插好了以后(即轉(zhuǎn)子中的4個(gè)或6個(gè)槽均插上了離心管)，旋上轉(zhuǎn)子的蓋子，再合上離心機(jī)的蓋子，在離心機(jī)面板上將“定時(shí)〞旋鈕州到21min，將“轉(zhuǎn)速〞旋鈕調(diào)到最大，插上電源插頭，開(kāi)啟“電源〞開(kāi)關(guān)，按下“啟動(dòng)〞按鈕。此時(shí)，離心機(jī)開(kāi)始加速旋轉(zhuǎn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速指針接近4000r／min時(shí)，將“轉(zhuǎn)速〞旋鈕回調(diào)至中間附近的位置(12點(diǎn)鐘位置)，轉(zhuǎn)速便會(huì)恒定在4000r／min。離心20min后，離心機(jī)遇自動(dòng)減速。必需等到轉(zhuǎn)速指針指爾為“0〞時(shí)，即轉(zhuǎn)子完全中止了旋轉(zhuǎn)，才能開(kāi)蓋取離心管，請(qǐng)觀看光盤中的視頻《離心機(jī)的使用》。

4．保存：將離心管中大部分上清液倒人量筒中，少部分接近沉淀物的上清液經(jīng)濾紙過(guò)濾，一并收入量筒中以測(cè)量體積，然后倒入三角燒瓶中．做好標(biāo)記，用塑料薄膜密閉，作為“原酶液〞在冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

以上操作請(qǐng)觀看光盤中的視頻《酸性磷酸酯酶的提取》。

5．洗凈所有用過(guò)的玻璃儀器、碾缽和離心管，整理清白桌面，請(qǐng)老師檢查五、計(jì)算上清液體積（mL）粗酶液得率（mL）=上清液體積綠豆芽莖質(zhì)量×100%六、本卷須知

1．使用離心機(jī)前必需將離心管(連同其蓋子)確切平衡。

2．離心過(guò)程中，若聽(tīng)到異常響聲，可能是出現(xiàn)了離心管破碎或離心管不平衡等狀況，應(yīng)馬上切斷電源，中止離心，檢查原因

3．在離心機(jī)高速運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中切勿開(kāi)啟離心機(jī)蓋，以防造成意外事故。

4．避免離心機(jī)連續(xù)使用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一般使用60min后要隔20~30min再使用。

5．有機(jī)溶劑會(huì)腐蝕離心管，酸、堿、鹽溶液會(huì)腐蝕金屬，若發(fā)現(xiàn)滲漏現(xiàn)象應(yīng)及時(shí)擦洗清白．以免損壞離心機(jī)。思考題

1．試驗(yàn)操作過(guò)程中為什么需戴上手套？

2．豆芽在碾缽中用碾錘完全搗碎對(duì)酶液提取起到什么作用?3．離心管巾的沉淀物可能是哪些成分？

試驗(yàn)二、酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的制作

一、目的

學(xué)會(huì)制作酶促反應(yīng)的進(jìn)程曲線，把握可見(jiàn)分光光度計(jì)的使用。二、原理

要進(jìn)行酶的活力測(cè)定，首先要確定酶的反應(yīng)時(shí)間。酶的反應(yīng)時(shí)間并不是任意規(guī)定的，應(yīng)當(dāng)在初速度范圍內(nèi)進(jìn)行選擇。要求出代表酶促反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍就必需制作酶促反應(yīng)的進(jìn)程曲線。所謂進(jìn)程曲線是指酶促反應(yīng)時(shí)間與產(chǎn)物生成量(或底物減少量)之間的關(guān)系曲線。它說(shuō)明白酶促反應(yīng)隨反應(yīng)時(shí)間變化的狀況。本試驗(yàn)的進(jìn)程曲線是在酶促反應(yīng)的最適條件下采用每間隔一定的時(shí)間測(cè)定產(chǎn)物生成量的方法，以酶促反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物生成量為縱坐標(biāo)繪制而成的。從進(jìn)程曲線可以看出，曲線的起始部分在某一段時(shí)間范圍內(nèi)呈直線，其斜率代表酶促反應(yīng)的初速度。但是，隨著反應(yīng)時(shí)問(wèn)的延長(zhǎng)，曲線的斜率不斷下降，說(shuō)明反應(yīng)速度逐漸降低。反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低這一現(xiàn)象可能是由于底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高使逆反應(yīng)加強(qiáng)等原因所致。因此，要真實(shí)反映出酶活力的大小，就應(yīng)當(dāng)在產(chǎn)物生成量與酶促反應(yīng)時(shí)間成正比的這一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。換言之，測(cè)定酶活力應(yīng)當(dāng)在進(jìn)程曲線的初速度時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行。制作進(jìn)程曲線，求出酶促反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍是酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)分析中的組成部分和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

三、試驗(yàn)器材

1．VIS-7220型可見(jiàn)分光光度計(jì)2．HH一2型數(shù)顯恒溫水浴鍋

3．取樣器：請(qǐng)參見(jiàn)試驗(yàn)一，5mL、1mL。各1支／組。4．試管：20支／組。5．試管架：1個(gè)／組。四、試驗(yàn)試劑

1．酸性磷酸酯酶酶液：取原酶液用0.2mol／L的pH5．6乙酸鹽緩沖液稀釋10～20倍。2．5mmol／L磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)：確切稱取磷酸苯二鈉(C6H6Na2PO4·2H2O，相對(duì)分子質(zhì)量254.10)2.54g，加蒸餾水溶解后定容至100mL，即配成了100mmol／L磷酸苯二鈉水溶液，密閉保存?zhèn)溆谩Ｓ?.2mol／L的pH5.6的乙酸鹽緩沖液稀釋20倍，即得5mmol／L磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)。

3．0.2mol／L的pH5.6乙酸鹽緩沖液。

4．Folin-酚試劑：于2000mL磨口回流裝置內(nèi)參與鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g，水700mL，85％磷酸50mL，濃鹽酸100mL。微火回流10h后參與硫酸鋰150g，蒸餾水50mL和溴數(shù)滴搖勻。煮沸約15min，以驅(qū)趕殘溴，溶液呈黃色，微弱帶綠色；如仍呈綠色，須重復(fù)滴加液體溴的步驟。冷卻后定容到1000mL，過(guò)濾，置于棕色瓶中可長(zhǎng)期保存，使用前，用蒸餾水稀釋3倍。5．1mol／L碳酸鈉溶液。6．0.4mmol／L酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：確切稱取分析純的酚結(jié)晶0.94g溶于0.1mol／L的HCl溶液中，定容至1000mL，即為酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液，貯存于冰箱可永久保存，此時(shí)的酚濃度約為0.01mol／L。使用前將上述的酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液用蒸餾水稀釋25倍，即得到0.4mmol／L酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。五、操作

檢查試管是否枯燥、清白；若否，將其洗凈并置于枯燥箱內(nèi)120℃烘干。

1．加樣與酶促反應(yīng)：取試管12支，按0到11的順序逐管編號(hào)，空白為0號(hào)。各管加0.5mL5mmol／L磷酸苯二鈉溶液，在35℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱2min后，在1～11管內(nèi)各參與0.5mL預(yù)熱的酶液。酶液一參與馬上確切計(jì)時(shí)井搖勻，按時(shí)間3、5、7、10、12、15、20、25、30、40和50min在35℃恒溫下進(jìn)行定時(shí)酶促反應(yīng)(酶液參與時(shí)為起始時(shí)間，碳酸鈉溶液加人時(shí)為終止時(shí)間)，參見(jiàn)圖8—2一4。當(dāng)酶促反應(yīng)進(jìn)行到上述相應(yīng)的時(shí)間時(shí)，參與1mol/L碳酸鈉溶液5mL終止反應(yīng)，時(shí)間控制詳見(jiàn)表。

管號(hào)1234567891011酶液參與時(shí)刻10（min11號(hào)試管最先加樣）碳酸鈉參與時(shí)刻（min）987654321013141517182024283241502．顯色：加完1mol／L碳酸鈉溶液5mL后再向試管中參與0.5mLFolin一酚稀溶液，混勻，保溫約10min即可顯色。空白管所加試劑一致，但酶液最終參與。

3．測(cè)定：冷卻后以0號(hào)管作空白，在可見(jiàn)光分光光度計(jì)上680nnl波優(yōu)點(diǎn)測(cè)定各管的吸光度A680。

4．畫圖：以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，A680為縱坐標(biāo)繪制進(jìn)程曲線，并將其貼在試驗(yàn)報(bào)告上，由進(jìn)程曲線求出酸性磷酸酯酶反應(yīng)初速度的時(shí)間范圍(直線部分涵蓋的時(shí)間)。

5．清潔：將用過(guò)的玻璃儀器和取樣器套頭洗凈，清潔分光光度計(jì)(特別是比色槽內(nèi))、清洗比色皿，整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請(qǐng)老師驗(yàn)收，試驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場(chǎng)交給老師。六、計(jì)算

七、本卷須知

1．酶促反應(yīng)應(yīng)保持溫柔條件，反應(yīng)液要避免猛烈攪拌或震蕩。2．試驗(yàn)前要設(shè)計(jì)好每支試管的加樣順序，確保反應(yīng)時(shí)間的確鑿性。3．酶促反應(yīng)的加樣順序不得搞錯(cuò)，否則無(wú)法顯色。思考題1．隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，曲線的斜率不斷下降，說(shuō)明反應(yīng)速度逐漸降低，這是為什么？2．假使酶促反應(yīng)在一個(gè)較大的體系中，如在燒杯中進(jìn)行，每隔一定的時(shí)間從燒杯中取樣測(cè)定該體系中產(chǎn)物的生成量，并繪制酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線，該方法和本書(shū)采用的方法結(jié)果會(huì)

一致嗎?哪個(gè)更好一些？

試驗(yàn)三、酸性磷酸酯酶的酶活力測(cè)定

一、目的

通過(guò)對(duì)酶促反應(yīng)速度的測(cè)定，計(jì)算出酶的活力，把握可見(jiàn)分光光度計(jì)的使用。二、原理請(qǐng)參見(jiàn)試驗(yàn)一三、試驗(yàn)器材請(qǐng)參見(jiàn)試驗(yàn)二四、試驗(yàn)試劑請(qǐng)參見(jiàn)試驗(yàn)二五、操作

檢查試管內(nèi)是否枯燥、清白；若否，將其洗凈并置于枯燥箱內(nèi)120℃烘干。1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取試管6支，按0到5的順序逐管編號(hào)，空白為0號(hào)。依照表8—3—1，向各試管中依次參與0.4mmol／L酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、0.2mol／L的pH5.6的乙酸鹽緩沖液、1mol／L碳酸鈉溶液和Folin一酚試劑，注意加樣順序不得搞錯(cuò)，否則顯不了色。搖勻，在35℃保溫10min以上(先用燒杯盛35℃的水，置于水浴鍋中，再將試管放人燒杯中保溫，以防試管滑落人水中)，參見(jiàn)試驗(yàn)八(2)的圖8—2—4。以0號(hào)試管為空白，在可見(jiàn)光分光光度計(jì)上680nm波優(yōu)點(diǎn)讀取各管的吸光度A680，以A680為橫坐標(biāo)、酚標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液的毫升數(shù)為縱坐標(biāo)作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，它應(yīng)當(dāng)是一條直線。保存該數(shù)據(jù)，以便試驗(yàn)八(4)直接引用。以上操作總結(jié)為表

2．酶活力的測(cè)定取2支試管，編號(hào)1’,0’，將0’號(hào)試管作為空白。在2支試管中備加人0.5mL的5mmol／L磷酸苯二鈉溶液，35℃預(yù)熱2min，再向1’號(hào)