水質(zhì) 總大腸菌群測定作業(yè)指導(dǎo)書

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水質(zhì)總大腸菌群測定作業(yè)指導(dǎo)書

1含義及執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)1.1

含義

總大腸菌群系指一群需氧及兼性厭氧的，在37℃生長時能使乳糖發(fā)酵，在24小時內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。1.2

方法原理

多管發(fā)酵技術(shù)是以最可能數(shù)（mostprobablenumber，簡稱MPN）來表示試驗結(jié)果的。它是根據(jù)統(tǒng)計學(xué)理論，通過水樣不同稀釋濃度多組重復(fù)生物培養(yǎng)陽性結(jié)果估計水體中被測生物密度的一種方法，具體是通過查MPN表獲得結(jié)果的。1.3

水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

表1-1總大腸菌群地下水質(zhì)量分類指標(biāo)（GB/T14848-93）類別標(biāo)準(zhǔn)值（個/L）Ⅰ類≤3.0Ⅱ類≤3.0Ⅲ類≤3.0Ⅳ類≤100Ⅴ類＞100表1-2總大腸菌群生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB5749-2023）類別標(biāo)準(zhǔn)值（個/L）飲用水（MPN/100mL或CFU/100mL）不得檢出表1-3總大腸菌群漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB11607-89）

類別標(biāo)準(zhǔn)值（個/L）1.4

水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)

表1-4總大腸菌群船舶污染物排放標(biāo)準(zhǔn)（GB3552-83）

類別標(biāo)準(zhǔn)值（個/L）內(nèi)河≤2500沿海（距最近陸地4海里以內(nèi)）≤2500沿海（距最近陸地4～12海里）≤10000貝類養(yǎng)殖≤500一般漁業(yè)用水≤5000表1-5總大腸菌群肉類加工工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)（GB13457-92）禽類屠宰加工、畜類屠宰加工、肉制品加工類別一級標(biāo)準(zhǔn)值（個/L）2分析方法2.1

方法名稱、方法來源及適用范圍

≤2500二級≤2500三級≤100001

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方法名稱：多管發(fā)酵法

方法來源：《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)國家環(huán)?？偩?023年第五篇其次章五(一)

方法適用范圍：此法適用于各種水樣（包括底泥）的總大腸菌群測定。2.2

儀器

高壓蒸汽滅菌器電熱枯燥箱恒溫培養(yǎng)箱顯微鏡冰箱

采樣瓶、三角燒瓶、試管、平皿（直徑9cm）、刻度吸管等器皿121℃（20min）高壓蒸汽滅菌后于電熱枯燥箱中烘干。2.3標(biāo)準(zhǔn)菌株制備

將標(biāo)準(zhǔn)菌株的母種或穩(wěn)定工作種接種到單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中培養(yǎng)對照控制。必需包括大腸埃希氏菌和山夫登堡沙門氏菌兩種對照。接種完后需記錄：母種的來源，母種和工作種的保存方法、保存溫度、傳代間隔時間、生長培養(yǎng)基及孵育條件，確認試驗（存活度、純度、關(guān)鍵診斷指標(biāo)等），母種到工作種的傳代代數(shù)。

2.4培養(yǎng)基

2.4.1單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：市售乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，按銘牌配制，用定量加液器分裝每個試管10ml，加塞，在115℃滅菌20min，貯存于暗處備用。

2.4.2三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：市售乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，按銘牌比例，三倍配制（蒸餾水除外），用定量加液器分裝每個試管5ml或每個大試管50mL，加塞，在115℃滅菌20min，貯存于暗處備用。

2.4.3品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基：市售品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基，按銘牌配制，分裝于三角燒杯內(nèi)，加塞，在115℃滅菌20min，貯存于冷暗處備用。

2.4.4伊紅美藍培養(yǎng)基：市售伊紅美藍培養(yǎng)基，按銘牌配制，分裝于三角燒杯內(nèi)，加塞，在115℃滅菌20min，貯存于冷暗處備用。

2.3.5培養(yǎng)基存放于帶紫外燈的滅菌物品專用貯藏柜中，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變化，或體積明顯變化時廢棄不用。2.5分析步驟2.5.1生活飲用水

①初發(fā)酵試驗：在二個裝有已滅菌的50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的大試管中（內(nèi)有倒管），以無菌操作各參與已充分混勻的水樣100ml；在10支裝有已滅菌的5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），以無菌操作參與充分混勻的水樣10ml，混勻后置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。

②平板分開：經(jīng)初發(fā)酵試驗培養(yǎng)24h后，發(fā)酵試管顏色變黃為產(chǎn)酸，小玻璃倒管內(nèi)有氣泡為

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產(chǎn)氣。將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸發(fā)酵管，分別用接種環(huán)劃線接種于品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍培養(yǎng)基上，置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h，挑揀符合以下特征的菌落，取菌落的一小部分進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。

品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上的菌落：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心色較深的菌落；伊紅美藍培養(yǎng)基上的菌落：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紫紅色，中心色較深的菌落。③復(fù)發(fā)酵試驗：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑揀該菌落的另一部分接種于普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中（內(nèi)有倒管），每管可接種分開自同一初發(fā)酵管的最典型菌落1～3個，然后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證明有大腸菌群菌存在。根據(jù)證明有大腸菌群存在的陽性管數(shù)查表6，報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。2.5.2水源水

①將水樣作1：10稀釋。

②于各裝有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的五個試管中（內(nèi)有倒管），各加10ml水樣；于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的五個試管中（內(nèi)有倒管），各加1ml水樣；于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的五個試管中（內(nèi)有倒管），各加1ml1:10稀釋的水樣。共計15管，三個稀釋度，將各管充分混勻，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。

③平板分開和復(fù)發(fā)酵試驗的檢驗步驟同（1）“生活飲用水〞檢驗方法。

④根據(jù)證明總大腸菌群存在的陽性管數(shù)查表7，即求得每100ml水樣中存在的總大腸菌群數(shù)。2.5.3地表水和廢水

①地表水中較清潔水的初發(fā)酵試驗步驟同2.5.2飲用水源水檢驗方法。有嚴重污染的地表水和廢水初發(fā)酵試驗的接種水樣應(yīng)作1：10，1：100；1：1000或更高的稀釋，檢驗步驟同2.5.2飲用水源水檢驗方法。

②假使接種的水樣量不是10ml，1ml和0.1ml，而是較低的或較高的三個濃度的水樣量，也可查表求得MPN指數(shù)，再經(jīng)下面的公式換算成每1L的MPN值，即為1L水樣中的總大腸菌群數(shù)。

MPN值?

MPN指數(shù)?2第一個濃度的接種量?103

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表6大腸菌群檢數(shù)表

（接種水樣100ml2份，10ml10份，總量300ml）

10ml水量的陽性管

數(shù)

012345678910

100ml水量的陽性瓶數(shù)

0

1L水樣中大腸菌群數(shù)

＜3371114182227313640

表7最可能數(shù)（MPN）表

（接種5份10ml水樣、5份1ml水樣、5份0.1ml水樣時，不同陽性及陰性狀況下100ml

水樣中細菌數(shù)的最可能數(shù)和95%可信限值）出現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml水樣中細10ml管0000111112221ml管0012001120010.1ml管010001010010菌數(shù)的最可能數(shù)＜222424466577＜0.5＜0.5＜0.5＜0.5＜0.5＜0.5＜0.5＜0.5＜0.51177117111115151317175555555下限上限10ml管444451ml管2334000111220.1ml管10100120120195%置信限值出現(xiàn)陽性份數(shù)每100ml水樣中細菌數(shù)的最可能數(shù)26273334233443334663497099111271115111621172378809393708911093120150130170下限95%置信限值上限1

1L水樣中大腸菌群數(shù)

48131824303643516069

2

1L水樣中大腸菌群數(shù)

11182738527092120161230＞230

4

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2223333333444444

123001122300111210001010100101209912811111414171713171721262222312244553557972121281925253434464631464663786755555555555555552333344444555555201230123401234594791101401801301702202803502403505409201600≥240028253137443543579012068120180300640220190250310500300190700850100075010001400320058003質(zhì)量控制要求3.1對照控制

采用無菌水作全過程對照控制，當(dāng)有明顯雜菌污染時，說明測定過程某環(huán)節(jié)無菌性失控，應(yīng)重新檢驗；采用陽性、陰性菌株作試驗室過程對照控制，當(dāng)陽性菌株不能生長或陰性菌株生長時，說明測定過程某環(huán)節(jié)失控，應(yīng)重新檢驗。3.2確切度

同一試驗人員所作前15個陽性水樣平行雙樣結(jié)果為X1i、X2i（X1i、X2i＞0，i＝1，2，?，15），則確切度判斷值＝3.27?R。

?logX1i?logX2i）

i?1當(dāng)分析所得R?logX1?logX2＞3.27?R表示縝密度已失控；否則平行雙樣的差

距可以接受。4數(shù)據(jù)處理4.1數(shù)據(jù)審核

分析結(jié)果填寫原始記錄表與樣品送檢單，應(yīng)經(jīng)科室內(nèi)部校對、審核后，方可上交。4.2數(shù)據(jù)填報

總大腸菌群報告以個/L單位填報，當(dāng)數(shù)量在100以內(nèi)按實有數(shù)據(jù)報告；大于100采用二位有效數(shù)字報告，有效數(shù)字后面的數(shù)值以四舍五入方法計算，為縮短數(shù)字后面的零數(shù)可用

5

（R?(?Ri)/15，Ri15常州市武進區(qū)環(huán)境監(jiān)測站作業(yè)指導(dǎo)書文件編號：WJES/QZ-0030-2023

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10的指數(shù)形式表示（如報告16，000或1.6×104）。5樣品采集

5.1采樣瓶應(yīng)經(jīng)高壓或干熱滅菌處理后方可使用；

5.2樣品含有余氯時采樣瓶滅菌前應(yīng)加脫氯劑，即于500mL采樣瓶中參與0.3mL10%硫代硫酸鈉溶液；

5.3樣品含銅鋅等重金屬較高時采樣瓶滅菌前應(yīng)加螯合劑，即于500mL采樣瓶中參與1.0mL15%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）溶液；

5.4同一地點同時采多瓶水樣時，細菌學(xué)檢驗水樣先采；5.5采樣時，采樣瓶不得用水樣蕩洗；

5.6采樣后，樣品應(yīng)2小時內(nèi)檢驗，否則，應(yīng)10℃以下保存且不超過6小時。6期間核查6.1人員素質(zhì)

首先要參與省上崗證理論考試，理論考試合格后方能上崗。同時站內(nèi)進行操作技能考核、培訓(xùn)，考核合格后方能持證上崗，承但本項分析。按國家和省環(huán)境監(jiān)測中心的要求，必需進行五年換證的理論考試、操作技能考核。6.2儀器設(shè)備

臭氧殺菌效果、高壓鍋壓力表指示、恒溫培養(yǎng)箱溫控狀況每年由站質(zhì)管中心組織持證人員檢驗、校正，玻璃量具每三年由站質(zhì)管中心組織持證人員校正。7分析環(huán)境條件控制7.1儀器設(shè)備

保持試驗室環(huán)境整齊，定期檢查，避免恒溫培養(yǎng)箱溫控失控，做好儀器設(shè)備使用和保養(yǎng)記錄。7.2無菌室

定期采用消毒劑清潔無菌室，定期檢查臭氧殺菌效果，保證無菌室微生物試驗條件的滿足。

7.3分析環(huán)境條件檢查和記錄

每次分析樣品時，作無菌室空氣細菌培養(yǎng)對照，保證無菌室空氣微生物學(xué)質(zhì)量，并做好記錄。

編制：日期：審核：日期：審批：日期：修訂記錄：

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10的指數(shù)形式表示（如報告16，000或1.6×104）。5樣品采集

5.1采樣瓶應(yīng)經(jīng)高壓或干熱滅菌處理后方可使用；

5.2樣品含有余氯時采樣瓶滅菌前應(yīng)加脫氯劑，即于500mL采樣瓶中參與0.3mL10%硫代硫酸鈉