實(shí)驗(yàn)四PCR產(chǎn)物的T載體克隆和轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)四PCR產(chǎn)物的T載體克隆和轉(zhuǎn)化現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一重組DNA技術(shù)操作步驟現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一主要步驟：①制備目的基因和選擇相關(guān)載體②目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接③重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞④DNA重組體的篩選和鑒定⑤DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過(guò)程現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一

（三）PCR擴(kuò)增特定基因

（四）人工合成一、目的基因的獲得——分

（一）從基因組文庫(kù)中獲得

（二）從cDNA文庫(kù)中獲得現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫(kù)用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù)現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫(kù)

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制

從cDNA文庫(kù)獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一幾種常用克隆載體的比較注：+表示可用；-表示不可用比較內(nèi)容質(zhì)粒λ噬菌體黏性質(zhì)粒M13噬菌體克隆容量<10kb<22kb40～50kb<1kb基因組DNA文庫(kù)-++-cDNA文庫(kù)++--亞克隆+--+序列分析++-+E.coli表達(dá)++--二、載體的選擇與準(zhǔn)備——選現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一三、DNA分子的體外連接——接（一）黏性末端（二）人工接頭的使用（三）加入同聚體尾（四）平端連接現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一（一）黏性末端現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一（二）人工接頭現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一（三）加入同聚體尾待克隆DNA片段重組質(zhì)?；旌?、退火空白質(zhì)?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一（四）平端連接現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA

λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′3′5′現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一四、外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞——轉(zhuǎn)受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一

外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后，篩選含有目的基因的陽(yáng)性克隆并加以擴(kuò)增。所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR等。五、目的基因的篩選和鑒定——篩現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一1.借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選

(1)利用抗生素抗性標(biāo)志篩選(2)利用基因的插入失活/插入表達(dá)特性篩選(3)利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選2.序列特異性篩選

(1)RE酶切法(2)PCR法(3)核酸雜交法(4)DNA測(cè)序法

現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一（一）

遺傳學(xué)方法

1.插入滅活法現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一插入失活篩選帶有重組載體的克隆現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一2.藍(lán)-白篩選（α互補(bǔ)）

許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和氨基端145個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片段各自均無(wú)酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源DNA片段，將使lacZ基因滅活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色?，F(xiàn)在是24頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一α互補(bǔ)篩選（藍(lán)-白篩選）現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一PCR產(chǎn)物的T載體

克隆和轉(zhuǎn)化

現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

學(xué)習(xí)T載體的特點(diǎn)和PCR產(chǎn)物的克隆方法。實(shí)驗(yàn)要求：

掌握利用T載體克隆PCR產(chǎn)物的方法；復(fù)習(xí)連接實(shí)驗(yàn)流程。技術(shù)應(yīng)用：

目的基因片段與T載體DNA連接，達(dá)到克隆基因的目的。現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一材料：目的基因片段（回收的PCR產(chǎn)物）藥品：pEMGT-Vector(Promega公司)現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一

質(zhì)粒（plasmid）是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA

分子。大小約為數(shù)千堿基對(duì)。常有1~3個(gè)抗藥性基因，以利于篩選?，F(xiàn)在是30頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入，儲(chǔ)存。主要是DNA水平上的操作?；虮磉_(dá)的質(zhì)粒載體

允許外源DNA的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)?，F(xiàn)在是31頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)原理普通Taq酶會(huì)在3′末端加一個(gè)A，這樣所有PCR產(chǎn)物都會(huì)在雙鏈DNA的3′端均有一個(gè)單鏈狀態(tài)的A；T-載體是線狀DNA片段，在DNA雙鏈的3′端均有一個(gè)單鏈狀態(tài)的T；二者在連接酶的作用下連接為一個(gè)重組的環(huán)狀分子，從而達(dá)到克隆的目的?，F(xiàn)在是33頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一載體結(jié)構(gòu)的三大要素：

多克隆位點(diǎn)選擇標(biāo)記（耐藥性，LacZ）獨(dú)立的復(fù)制單位現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一pGEM-T載體的結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一pGEM-TEasy載體的結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一實(shí)驗(yàn)步驟（1）目的片段的制備--膠回收法回收PCR產(chǎn)物：現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期一(2)連接實(shí)驗(yàn)：在0.2mlPCR管加入以下試劑：目的片段（100ng/ul）3μl