中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程培訓(xùn)課件

中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程1.1無菌操作要求

1.1.1接種細(xì)菌時(shí)必須穿工作服、戴工作帽。1.1.2專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。1.1.3接種樣品時(shí)，應(yīng)在進(jìn)無菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程

1.1無菌操作要求

1.1.4進(jìn)行接種所用的吸管，平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用95%酒精點(diǎn)燃燒灼三次后使用。1.1.5從包裝中取出吸管時(shí)，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時(shí)，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。3中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程1.1無菌操作要求1.1.6接種樣品、轉(zhuǎn)種細(xì)菌必須在酒精燈旁操作，接種細(xì)菌或樣品時(shí)，吸管從包裝中取出后及打開試管塞（即硅氟膠塞）都要通過火焰消毒。1.1.7接種環(huán)和針在接種細(xì)菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時(shí)還要燒到環(huán)和針與桿的連接處。1.1.8吸管吸取菌液或樣品時(shí)，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。

4中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程1.2無菌間使用要求1.2.1

無菌間內(nèi)應(yīng)保持清潔，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的物品。

1.2.2無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈，照射時(shí)間不少于30min，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。

5中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程1.3消毒滅菌要求

1.3.1滅菌前準(zhǔn)備1.2.3處理和接種樣品時(shí)，進(jìn)入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。（1）所有需要滅菌的物品首先應(yīng)清洗晾干，玻璃器皿用紙包裝嚴(yán)密，如用金屬筒應(yīng)將上面通氣孔打開。（2）裝培養(yǎng)基的三角瓶，內(nèi)容物不應(yīng)超過總體積的2/3（例如500mL的三角瓶最好裝300～350mL培養(yǎng)基，以防再次加熱融化時(shí)爆沸）。（3）無菌室內(nèi)使用的毛巾、脫脂棉球用紙包裹，進(jìn)行濕熱滅菌。6中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程1.3.2裝放（1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠，且不能接觸箱的四壁。（2）大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。7中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程1.3.3設(shè)備檢查（1）檢查門的開關(guān)是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。（2）檢查壓力表蒸氣排盡時(shí)是否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計(jì)所標(biāo)示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。（3）對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序，是否符合于進(jìn)行滅菌處理的要求。8中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程1.3.4滅菌處理(1)干熱滅菌法：用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。滅菌完畢后或溫度升溫過程中，須在60℃以下才能打開箱門。(2)立式壓力蒸氣滅菌器：待壓力恢復(fù)到零時(shí)，自然冷卻至60℃后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應(yīng)立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復(fù)至零，溫度降到60℃以下再開蓋取物，以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破。9中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程（3）物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉、包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用。培養(yǎng)基或試劑等,應(yīng)檢查是否符合達(dá)到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達(dá)到者應(yīng)廢棄。取出的物品掉落在地或誤放不潔處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用。取出的合格滅菌物品,應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi),嚴(yán)禁與未滅菌物品混放。凡屬合格物品,應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限。10中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程1.4有毒有菌污物處理要求1.4.1經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應(yīng)放在嚴(yán)密的容器或鐵絲筐內(nèi)，并集中存放在指定地點(diǎn)，待統(tǒng)一進(jìn)行高壓滅菌（經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物，必須經(jīng)121℃30min高壓滅菌）。1.4.2染菌后的吸管（即進(jìn)行陽性菌操作后的），使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經(jīng)121℃30min高壓滅菌。11中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程

有毒有菌污物處理要求

1.4.3涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，強(qiáng)致病菌的沖洗液必須沖在燒杯中，經(jīng)高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24h后，煮沸洗滌。做凝集試驗(yàn)用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。1.4.4打碎的培養(yǎng)物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時(shí)后再擦拭干凈。12中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程有毒有菌污物處理要求1.4.5污染的工作服或進(jìn)行強(qiáng)致病菌試驗(yàn)所穿的工作服、帽、口罩等，應(yīng)放入專用消毒袋內(nèi)，經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。

1.5培養(yǎng)基制備要求1.5.1根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱?。筛鶕?jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進(jìn)行），然后溶于蒸餾水中，在使用前對應(yīng)用的試劑藥品應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。1.5.2因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的PH降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多，以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量。13中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程

有毒有菌污物處理要求

1.5.3盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器（三角燒瓶）為好。1.5.4每批培養(yǎng)基制備好后，應(yīng)做無菌生長試驗(yàn)（空白平皿試驗(yàn)）及所檢菌株生長試驗(yàn)。如果是生化培養(yǎng)基，使用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種培養(yǎng)，觀察生化反應(yīng)結(jié)果，應(yīng)呈正常反應(yīng)，培養(yǎng)基不應(yīng)貯存過久，必要時(shí)可置4℃冰箱存放。14中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程2.實(shí)驗(yàn)操作2.1準(zhǔn)備用具，配制培養(yǎng)基、稀釋液、培養(yǎng)箱2.1.1用具：150mL三角燒瓶試管1mL移液管10mL移液管2.1.2培養(yǎng)基：需氧菌菌總數(shù)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、霉菌和酵母菌總數(shù)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基控制菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基腸道菌增菌液體培養(yǎng)基麥康凱液體培養(yǎng)基RV沙門增菌液體培養(yǎng)基接種平板紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基15中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程

實(shí)驗(yàn)操作

2.1.3稀釋液：0.9%無菌氯化鈉溶液2.1.4培養(yǎng)箱：3個(gè)（30?35℃、20?25℃、42?44℃）2.2培養(yǎng)基配制2.3滅菌2.4無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24至48小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。2.5無菌室準(zhǔn)備：用消毒液擦拭無菌室，將本次試驗(yàn)所用的器皿、培養(yǎng)基通過傳遞窗送到無菌室，，樣品置于傳遞窗，一次性使用物料（工作服、口罩、手套）置于緩沖間。開啟凈化系統(tǒng)1小時(shí)，關(guān)閉凈化系統(tǒng)，打開紫外燈0.5小時(shí)，關(guān)閉紫外燈，至少0.5小時(shí)后進(jìn)入無菌室。16中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程Titleandcontentlayout(Textpage)2.6.2平皿的制備：3個(gè)稀釋級（常用10-1、10-2、10-3）（每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板），同時(shí)做空白（等量稀釋劑）〖供試液用量為適應(yīng)性試驗(yàn)確定的，常用1ml〗2.6.3加入培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基，融化并讓其冷卻至45℃左右，傾入已加入供試液的平皿中，每個(gè)平皿約15mL（即傾倒時(shí)液面剛剛閉合時(shí)），在超凈臺面上輕輕晃動使供試液均勻混合于培養(yǎng)基中，放置一旁待冷卻凝固。18中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程2.6.4培養(yǎng)：待平皿完全冷卻凝固，通過傳遞窗取出，倒置疊放置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)時(shí)間及溫度：需氧菌菌總數(shù)30?35℃培養(yǎng)3?5天霉菌和酵母菌總數(shù)20?25℃培養(yǎng)5?7天，19中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程2.7控制菌檢驗(yàn)2.7.1供試液制備：取供試品10g，用稀釋劑制成1:10供試液，混勻，在20?25℃培養(yǎng)約2小時(shí)(可以在無菌室中先做這一步，等其余試驗(yàn)步驟完成，再繼續(xù)進(jìn)行控制菌的下一步)。耐膽鹽革蘭陰性菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基大腸埃希氏菌0.9%無菌氯化鈉溶液沙門菌直接取樣品10g或10ml20中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程2.7.2預(yù)培養(yǎng)（增菌培養(yǎng)）：取供試液10mL（相當(dāng)于1g樣品），加在ml增菌液體培養(yǎng)基（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）中，30?35℃培養(yǎng)24?48小時(shí)。耐膽鹽革蘭陰性菌腸道菌增菌液體培養(yǎng)基大腸埃希氏菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基沙門菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基21中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程2.7.3選擇和分離培養(yǎng)2.7.3.1耐膽鹽革蘭陰性菌：取相當(dāng)于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml和0.001tnl)供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積(經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30?35℃培養(yǎng)24?48小時(shí)。2.7.3.2大腸埃希氏菌：lml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42?44℃培養(yǎng)24?48小時(shí)。22中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程

選擇和分離培養(yǎng)

2.7.3.3沙門菌：0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，30?35℃培養(yǎng)18?24小時(shí)。2.7.4平板劃線分離培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基平板的準(zhǔn)備：取培養(yǎng)基，融化并讓其冷卻至50℃左右，傾入滅菌平皿中，每個(gè)平皿約15mL，使其分布均勻，冷卻凝固后即為固體平板培養(yǎng)基。耐膽鹽革蘭陰性菌紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基大腸埃希氏菌麥康凱瓊脂培養(yǎng)基沙門菌木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基23中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程（2）各種物品的準(zhǔn)備取出預(yù)培養(yǎng)后的控制菌供試液，置于工作臺上；接種前準(zhǔn)備好酒精燈、一次性接種針、火柴、酒精棉球、試管架等?？稍陉栃跃一驘o菌室操作，無菌室準(zhǔn)備工作相同。（3）平板劃線以左手持平板，中指、無名指和小指托著平板底,拇指和食指打開上蓋，使蓋與底成30°角，以便劃線。24中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程Titleandcontentlayout(Textpage)右手握一次性接種針，把接種針上的菌液涂在培養(yǎng)基一側(cè)，一般作5-8次劃線。將環(huán)上的多余細(xì)菌材料燒掉后，從第1次劃線引出第2次劃線；再從第2次劃線引出第3次劃線，如此反復(fù)3-4次劃線后，即可把整個(gè)平板表面劃滿，注意每一次劃線只能與上一次劃線重疊，這樣就可在最后的1-2次劃線上出現(xiàn)多量的單個(gè)菌落，以便進(jìn)行純培養(yǎng)。25中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程Titleandcontentlayout(Textpage)2.7.4培養(yǎng)：接種后的平板倒置疊放置于培養(yǎng)箱中，30?35℃培養(yǎng)18?24小時(shí)。2.8培養(yǎng)物的觀察2.8.1需氧菌總數(shù)：每天觀察菌落的生長情況，如數(shù)目多，應(yīng)及時(shí)點(diǎn)計(jì)。2.8.2霉菌和酵母菌總數(shù)：每天觀察菌落的生長情況，如數(shù)目多，應(yīng)及時(shí)點(diǎn)計(jì)。2.8.3大腸埃希菌：每天觀察菌落的生長情況。2.8.4沙門氏菌：菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。如有疑似菌落則用接種針挑選于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18?24小時(shí)，或采用其他適宜方法進(jìn)一步鑒定。26中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程3.數(shù)據(jù)報(bào)告3.1平皿法：點(diǎn)計(jì)平板上生長的所有菌落數(shù)，計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。27中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程3.2控制菌3.2.1耐膽鹽革蘭陰性菌：紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2查lg或lml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。3.2.2大腸埃希菌：若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。28中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程3.2.3沙門菌：若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色（或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。29中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程Titleandcontentlayout(Textpage)3.3報(bào)告規(guī)則：需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于l00cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。取最髙的平均菌落數(shù)，計(jì)算lg、lmL或10cm2供試品中所含的微生物數(shù)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以<1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。3.4結(jié)果判斷：10cfu：可接受的最大菌數(shù)為20100cfu：可接受的最大菌數(shù)為2001000cfu：可接受的最大菌數(shù)為2000，依此類推30中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程Titleandcontentlayout(Textpage)3.5限度標(biāo)準(zhǔn)：3.5.1不含中藥原粉的口服中藥制劑：需氧菌總數(shù)103cfu（≤2000）102cfu（≤200）霉菌和酵母菌總數(shù)102cfu（≤200）101cfu（≤20）大腸埃希菌不得檢出沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出3.5.2含中藥原粉的口服中藥制劑3.5.2.1不含發(fā)酵原粉需氧菌總數(shù)104cfu（≤20000）5×102cfu（≤1000）霉菌和酵母菌總數(shù)102cfu（≤200）102cfu（≤20）大腸埃希菌不得檢出31中國藥典檢驗(yàn)操作規(guī)程Titleandcontentlayout(Textpage)沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌＜1003.5.2.2含發(fā)酵原粉需氧菌總數(shù)