數(shù)據(jù)預處理綜述

本文格式為Word版，下載可任意編輯——數(shù)據(jù)預處理綜述正態(tài)但偏離理論分布的狀況提醒我們可能有系統(tǒng)偏差。偏離理論分布的reads超過15%時，報\；偏離理論分布的reads超過30%時，報\。

7PerBaseNContent：當測序儀器不能分辯某條reads的某個位置終究是什么堿基時，就會產(chǎn)生“N〞。對所有reads的每個位置，統(tǒng)計N的比率。正常狀況下N的比例是很小的，所以圖上往往看到一條直線，但放大Y軸之后會發(fā)現(xiàn)還是有N的存在，這不算問題。當Y軸在0%-100%的范圍內(nèi)也能看到“鼓包〞時，說明測序系統(tǒng)出了問題。當任意位置的N的比例超過5%，報\；當任意位置的N的比例超過20%，報\。

8SequenceLengthDistribution:reads長度的分布。當reads長度不一致時報\；當有長

度為0的read時報“FAIL〞。

9DuplicateSequences:統(tǒng)計序列完全一樣的reads的頻率。測序深度越高，越簡單產(chǎn)生一定程度的duplication，這是正常的現(xiàn)象，但假使duplication的程度很高，就提醒我們可能有bias的存在（如建庫過程中的PCRduplication）。橫坐標是duplication的次數(shù)，縱坐標是duplicatedreads的數(shù)目，以uniquereads的總數(shù)作為100%。上圖的狀況中，相當于uniquereads數(shù)目～20%的reads是觀測到兩個重復的，～7%是觀測到三次重復的，依此類推?？梢韵胂螅偈乖紨?shù)據(jù)很大（事實往往如此），做這樣的統(tǒng)計將十分慢，所以fastqc中用fq數(shù)據(jù)的前200,000條reads統(tǒng)計其在全部數(shù)據(jù)中的重復狀況。重復數(shù)目大于等于10的reads被合并統(tǒng)計，這也是為什么我們看到上圖的最右側(cè)略有上揚。大于75bp的reads只取50bp（不知道怎么選的）進行比較。但由于reads越長越不簡單完全一致（由測序錯誤導致），所以其重復程度仍有可能被低估。當非unique的reads占總數(shù)的比例大于20%時，報\；當非unique的reads占總數(shù)的比例大于50%時，報\“。

10OverrepresentedSequences:假使有某個序列大量出現(xiàn)，就叫做over-represented。fastqc

的標準是占全部reads的0.1%以上。和上面的duplicateanalysis一樣，為了計算便利，只取了fq數(shù)據(jù)的前200,000條reads進行統(tǒng)計，所以有可能over-representedreads不在里面。而且大于75bp的reads也是只取50bp。假使命令行中參與了-ccontaminantfile，出現(xiàn)的over-representedsequence會從contaminant_file里面找匹配的hit（至少20bp且最多一個mismatch），可以給我們一些線索。

當發(fā)現(xiàn)超過總reads數(shù)0.1%的reads時報〞WARN“，當發(fā)現(xiàn)超過總reads數(shù)1%的reads時報〞FAIL“。

11OverrepresentedKmers:假使某k個bp的短序列在reads中大量出現(xiàn)，其頻率高于統(tǒng)計期望的話，fastqc將其記為over-representedk-mer。默認的k=5，可以用-k--kmers選項來調(diào)理，范圍是2-10。出現(xiàn)頻率總體上3倍于期望或是在某位置上5倍于期望的k-mer被認為是over-represented。fastqc除了列出所有over-representedk-mers，還會把前6個的perbasedistribution畫出來。當有出現(xiàn)頻率總體上3倍于期望或是在某位置上5倍于期望的k-mer時，報〞WARN“；當有出現(xiàn)頻率在某位置上10倍于期望的k-mer時報\。2

）

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2）Trimmomatic

它是一個針對Illumina高通量測序的readstrim的工具。即能夠針對paired-end也能弄singleended.它能夠利用FASTQ文件（phred+33或者是phred+64堿基質(zhì)量格式，取決于Illumina測序的機器）.對于single-ended，一個輸入文件和一個輸出文件，加上參數(shù)。對于paired-end數(shù)據(jù)，兩個輸入文件，4個輸出文件，分別為2個是'paired'，2個是'unpaired'（一個為forward的,一個為reverse的）。Trimmomatic用兩種策略來去除adapter:PalindromeandSimple

simpletrimming是利用每一個adapter序列去跟reads匹配，假使匹配上，就刪除read的這部分序列。

Palindrometrimming是在adapter序列中readingthrough一個短的片段。在這個方法中，

相應(yīng)的adapter序列在硅片上的連接被連接到了reads的開始，形成了adapter+read序列，正鏈和反鏈比對，假使比對顯示read-through，正鏈剪切掉adapter，反鏈去掉（由于它沒有包含新的數(shù)據(jù)）Trimmomatic功能強大包括如下功能：

ILLUMINACLIP:Cutadapterandotherillumina-specificsequencesfromtheread.

SLIDINGWINDOW:Performaslidingwindowtrimming,cuttingoncetheaveragequalitywithinthewindowfallsbelowathreshold.

LEADING:Cutbasesoffthestartofaread,ifbelowathresholdqualityTRAILING:Cutbasesofftheendofaread,ifbelowathresholdqualityCROP:Cutthereadtoaspecifiedlength

HEADCROP:CutthespecifiednumberofbasesfromthestartofthereadMINLEN:Dropthereadifitisbelowaspecifiedlength

TOPHRED33:Conver