(11)-質(zhì)粒酶切及PCR鑒定生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

質(zhì)粒酶切及PCR鑒定1.掌握PCR的原理及應(yīng)用2.熟悉重組質(zhì)粒鑒定的方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇嬖谟诩?xì)菌細(xì)胞內(nèi)、染色體外、共價(jià)閉合的小型環(huán)狀DNA分子具有自我復(fù)制功能。帶有抗性基因及表型識(shí)別等遺傳性標(biāo)記物經(jīng)改造后具有多克隆位點(diǎn)。質(zhì)粒制性核酸內(nèi)切酶：基因工程的手術(shù)刀是分子生物學(xué)研究中的一種工具酶，能識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。酶切識(shí)別序列通常屬于回文結(jié)構(gòu)XbaⅠTAGATCCTAGA

T+TCTAGAAGATCT粘端切口AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAA

HindⅢ酶切體系：10×Buffer2μl（10μmol/L）HindⅢ0.5ulXbaⅠ0.5ulDNA0.5-1ug(5ul)ddH2O12ul總體積20ul混勻，37℃水浴1-2h。HindIII插入基因1.7kbXbaI6.4kb

利用DNA半保留復(fù)制原理和DNA的變性和復(fù)性的特性，在DNA聚合酶、引物、模板和底物存在下，實(shí)現(xiàn)DNA的體外擴(kuò)增。PCR技術(shù)的基本原理:

PCR鑒定根據(jù)插入目的基因片段設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行鑒定。XbaⅠHindⅢ1.7KB6.4KB產(chǎn)物500bp引物5Primer

15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555基本工作原理Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。實(shí)驗(yàn)原理模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分(要素)模板單/雙鏈DNA或RNA都可以進(jìn)行PCR，但如果樣品是RNA，則需要先反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再進(jìn)行PCR，此稱為反轉(zhuǎn)錄PCR。PCR對(duì)模板的純度要求不太嚴(yán)格。一般102～104拷貝數(shù)的模板即可滿足各種PCR反應(yīng)。模板DNA中目的序列所占比例越高，非特異產(chǎn)物越少。TaqDNA聚合酶在其它參數(shù)最佳時(shí)，TaqDNA聚合酶用量為1-2.5U/100μ1時(shí)效果最佳。TaqDNA聚合酶用量過多不但造成浪費(fèi)，還可使非特異產(chǎn)物增加，靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物降低；過低時(shí)，則靶序列產(chǎn)量很低。酶的最適用量可根據(jù)不同的模板分子或引物而變化。最好在100μ1反應(yīng)體積中加入0.5-5U酶試驗(yàn)最佳酶濃度。引物

PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上、下游引物決定的,引物是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)原則：引物的長度以15-30bp為宜。引物中的堿基分布是隨機(jī)的，盡量避免相同堿基的連續(xù)排列。（G+C）的含量在45-55%，引物的Tm值可用公式計(jì)算：[Tm=4(G+C)+2(A+T)]，Tm值高于55℃。避免兩引物間的互補(bǔ)，以免形成引物二聚體。引物一定要與模板DNA配對(duì)；引物必須經(jīng)GenBank查詢后，證實(shí)沒有與其他非目的DNA有高度互補(bǔ)，才能使用。

dNTPs等2mmol/LdNTP貯備液：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP4種脫氧核苷酸。

10×PCR緩沖液：500mmol/LKCl，100mmol/LTris-HCl(pH8.4，20℃)，（150mmol/LMgCl2

），1mg/ml明膠。Mg2＋，150mmol/LMgCl2

PCR體系Template50-100ng(1ul)引物(F+R,10uM)1.0μl（10μmol/L）PCRMIX18μl（10μmol/L）總體積20ulbuffer，dNTPs,TaqDNA聚合酶PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C94℃,2min94℃,30S55℃,30S72℃,30S72℃,10min25cyclesPCR擴(kuò)增條件:實(shí)驗(yàn)流程構(gòu)建酶切