流式細(xì)胞儀的應(yīng)用

流式細(xì)胞儀的應(yīng)用第1頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一流式細(xì)胞術(shù)在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用細(xì)胞活力的檢測細(xì)胞周期分析細(xì)胞凋亡分析多藥耐藥基因研究（MDR）RNA測定、DNA測定細(xì)胞內(nèi)離子的測定及pH值測定第2頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用白血病免疫分型HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎淋巴細(xì)胞亞群造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)：造血干細(xì)胞移植網(wǎng)織紅細(xì)胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗(yàn)第3頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一

guavaeasyCyte?8HT微毛細(xì)管細(xì)胞分析儀

廠家：Millipore

獲獎理由：突破性的微毛細(xì)管技術(shù)，無需鞘液，樣品體積少，廢液更少，讓細(xì)胞分析變得更簡單、快捷、易于操控4第4頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一Guava多種分析GuavaViaCount活細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)√

GuavaCellCycle細(xì)胞周期分析√GuavaExpressCellSurfaceAntigenDetection細(xì)胞表面蛋白檢測√GuavaRapidQuant小鼠及人的IgG定量√細(xì)胞凋亡√

GuavaNexinAnnexinV結(jié)合√

GuavaCaspase3/7√

GuavaCaspase8√

GuavaMultiCaspase√

GuavaTUNEL√

GuavaMitoPotential線粒體膜電位√

細(xì)胞示蹤√

GuavaCellToxicity細(xì)胞毒性：NK，CMC，ADCC√

GuavaCellPaint靶細(xì)胞監(jiān)測√

GuavaCellGrowth細(xì)胞增殖：原代細(xì)胞√

第5頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第6頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞活力的檢測在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力。第7頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第8頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第9頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一DeadCellDiscriminationCellsshouldnotbefixed/permeabilizedpriortorunningontheflowcytometer.Cellsareincubatedonicefor1-5minutesinPIatafinalconcentrationof2ug/ml.第10頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞周期分析

第11頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第12頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一在細(xì)胞周期內(nèi)DNA含量各時期發(fā)生周期性變化，通過熒光探針對細(xì)胞進(jìn)行相對DNA含量測定，可分析細(xì)胞周期各時期相對的百分比，了解細(xì)胞群體的倍體性和增殖能力。DNA含量常和某種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白同時檢測，來分析細(xì)胞處于某一特定周期階段。惡變腫瘤細(xì)胞一般多出現(xiàn)異倍體，DNA含量分析對腫瘤的診斷預(yù)后有很高的價值,尤其對細(xì)胞毒性藥物的研究很有價值。第13頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAcontentCount2N4NG0期細(xì)胞被認(rèn)為是不參與增殖周期循環(huán)的一群細(xì)胞，即為靜止細(xì)胞，其細(xì)胞DNA含量為較恒定的2N值，G1期細(xì)胞與G0期細(xì)胞DNA值相同，均為二倍體DNA含量，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期后，DNA含量逐漸增加，當(dāng)細(xì)胞DNA倍增結(jié)束，進(jìn)入G2期，最終進(jìn)入M期，在M期分裂為兩個子細(xì)胞之前，G2和M期細(xì)胞的DNA含量均為恒定的4N值，即為四倍體細(xì)胞群。第14頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一G0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEventsAtypicalDNAHistogramofcellproliferation第15頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一樣品制備

1000rpm5分鐘收集2X106個細(xì)胞PBS漂洗兩次70%酒精4度固定過夜收集固定的細(xì)胞PBS漂洗0.5mlPBS懸浮細(xì)胞2.5μl10μg/μlRNaseA37度消化1小時過300目細(xì)胞篩50μl0.1mg/mlPI（含1%Triton)1000rpm5分鐘離心兩次混勻，室溫靜止5分鐘上機(jī)第16頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一經(jīng)RNA酶處理前后的比較RNA也是核酸，也會被PI染色，為避免干擾,染色前需用RNAse降解RNA。這樣PI只染DNA，能精確以熒光強(qiáng)度反映DNA的含量。第17頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一結(jié)果解讀G0/G1期細(xì)胞占總的61.2%，峰位于橫座標(biāo)的45.76G2/M期占13.07，峰位于橫座標(biāo)的91.43S期占25.73G2/G1為2.0（即G2期為4倍體細(xì)胞，而G1期為2倍體細(xì)胞，比值為2）峰的變異系數(shù)為4.54%（好）細(xì)胞碎片為0.48%，細(xì)胞聚集體有0.06%。總的細(xì)胞數(shù)（儀器檢測到的）為17525個，在細(xì)胞周期中分析的細(xì)胞數(shù)為17431個（即排除了碎片及聚集體后）CV是變異系數(shù)。一般CV越小，峰形越好，越尖銳。能控制在5%左右是比較好的結(jié)果，一般小于10%就可以認(rèn)可了。

第18頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一應(yīng)用DNA含量測定鑒定細(xì)胞凋亡如果有凋亡，在G0/G1期前面有個凋亡峰(也稱sub-G0期)在凋亡細(xì)胞中，用PI染色，通過流式檢測DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細(xì)胞，其染色熒光強(qiáng)度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進(jìn)行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細(xì)胞內(nèi)DNA含量下降造成的。第19頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一FlowCytometryofApoptoticCellsPI-Fluorescence#EventsApoptoticcellsNormalG0/G1cells第20頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一缺乏IL-3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡第21頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第22頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一在DNA直方圖上區(qū)分凋亡峰和細(xì)胞碎片峰上圖為細(xì)胞碎片峰，在二倍體G0/1峰之前呈左高右低的拋物線（藍(lán)色）上圖為細(xì)胞凋亡峰，在二倍體G0/1峰之前呈對稱分布的拋物線（藍(lán)色）第23頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一流式細(xì)胞術(shù)在生殖醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用精子細(xì)胞和精子為單倍體細(xì)胞1C;次級精母細(xì)胞為二倍體細(xì)胞2C;初級精母細(xì)胞和處于G2M期的精原細(xì)胞4C第24頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞凋亡分析

第25頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞凋亡特點(diǎn)：染色質(zhì)的濃縮,核膜及細(xì)胞膜的內(nèi)陷,接著核碎裂成分離的片段,凋亡小體(apoptosisbody)的出現(xiàn)。在流式細(xì)胞儀上，對于光散射特性觀察凋亡細(xì)胞的改變：由于細(xì)胞的固縮，體積變小，F(xiàn)SC會變小，而細(xì)胞碎片及顆粒增多，SSC也會改變。第26頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一在細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化第27頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一早早期凋亡的檢測---capase3早期凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法早期凋亡線粒體細(xì)胞膜電位的檢測晚期凋亡----“TUNEL”法晚晚期凋亡-----DNA含量分析法第28頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第29頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一caspase-3Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。第30頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一MassivesubstratecleavageApoptosisSignalingReceptorCamptothecinFasLFADDPro-caspase–8MitochondrialActivecaspase–8?StaurosporineDNAdamageActiveBid+Pro-caspase–9+Apaf-1+CytcActivecaspase–9Activecaspase–3(6,7)Z–VADZ–VADMitochondriaFasPro-caspase–3(6,7)Z–VADDEATH第31頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一FlowCytometricAnalysisofApoptosis

inJurkatTCellsRelativeCellNumberActiveCaspase-3–FITC00.5124IncubationwithCamptothecin喜樹堿(hr)第32頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一早早期凋亡的檢測capase3早期凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法早期凋亡線粒體細(xì)胞膜電位的檢測晚期凋亡----“TUNEL”法晚晚期凋亡-----DNA含量分析法第33頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一Annexin-V-FITC/PI雙染法正常細(xì)胞膜磷脂的分布是不對稱的，膜內(nèi)表面含有帶負(fù)電的磷脂（如磷脂酰絲氨酸，PS），而膜外表面含有占絕大多數(shù)的中性磷脂。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞表面發(fā)生變化，細(xì)胞膜內(nèi)部的PS遷移到細(xì)胞外層表面。AnnexinV是一種對Ca2+依賴，對PS有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可作為探針識別細(xì)胞膜表面是否有PS，從而識別凋亡細(xì)胞。第34頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一AnnexinVAssay第35頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻染色體局部凝聚第36頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一Annexin-V-FITC/PI雙染法由于壞死細(xì)胞也可能在細(xì)胞膜表面出現(xiàn)磷脂酰絲氨酸，又在細(xì)胞凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其初期。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞DNA可被PI著染而產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號，正?；罴?xì)胞與此相似。在流式細(xì)胞術(shù)雙參數(shù)散點(diǎn)圖上左下象限顯示活細(xì)胞，為（AnnexinV-/PI-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為AnnexinV+/PI+；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)AnnexinV+/PI-。第37頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第38頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一AnnexinVAssay

區(qū)分死亡與凋亡第39頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一AnnexinV-PIAnalysisCamptothecin:喜樹堿，抗腫瘤藥物第40頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第41頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一實(shí)驗(yàn)步驟1.離心收集懸浮細(xì)胞，微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速2000RPM，離心時間5min，棄培養(yǎng)基。2.

用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。3.用400ul1XBindingBuffer懸浮細(xì)胞，濃度大約為1X106cells/ml。4.在細(xì)胞懸浮液中加入5ulAnnexinV-FITC，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育15分鐘。5.加入10ulPI后輕輕混勻，于2-8°C避光條件下孵育5分鐘。6.

在1小時內(nèi)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測。第42頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一早早期凋亡的檢測capase3

早期凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法早期凋亡線粒體細(xì)胞膜電位的檢測晚期凋亡----“TUNEL”法晚晚期凋亡-----DNA含量分析法第43頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一原理細(xì)胞凋亡與壞死在形態(tài)特征上有明顯的區(qū)別，根據(jù)細(xì)胞凋亡和壞死的形態(tài)特點(diǎn)，一般認(rèn)為在細(xì)胞壞死早期就會出現(xiàn)細(xì)胞膜通透性及線粒體跨膜電位的改變，而在細(xì)胞凋亡時這些改變的發(fā)生則要晚。一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。

第44頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一凱基細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）

（JC-1ApoptosisDetectionKit）采用一種陽離子脂質(zhì)熒光染料JC-1作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時以單體的形式存在，高濃度時以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同，單體在流式細(xì)胞儀綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光，多聚體在流式細(xì)胞儀紅色（FL-2）通道檢測出紅色熒光。JC-1可透過正常細(xì)胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi)，正常健康線粒體的膜電位（△y）具有極性，JC-1依賴于△y的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，發(fā)射紅色熒光。而細(xì)胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，紅光強(qiáng)度減弱，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。第45頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一

凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)P388細(xì)胞凋亡，利用凱基細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）進(jìn)行檢測，通過流式細(xì)胞儀分析分析結(jié)果。正常細(xì)胞{FL-1亮,FL-2亮;R1}，凋亡細(xì)胞{FL-1亮,FL-2暗;R2}R1R2R3R4R1R2R3R4第46頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一早早期凋亡的檢測capase3

早期凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法早期凋亡線粒體細(xì)胞膜電位的檢測晚期凋亡----“TUNEL”法晚晚期凋亡-----DNA含量分析法第47頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一原理細(xì)胞凋亡時，核酸內(nèi)切酶活化，雙鏈DNA會出現(xiàn)許多不對稱的斷裂點(diǎn)，即產(chǎn)生一系列3'-OH的末端。外源性熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltranferase,TdT）能夠催化外源性熒光素或酶標(biāo)記的dUTP連接到DNA的3'-OH末端，用流式細(xì)胞術(shù)檢測。第48頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一

BrdUrdIncorporationBrdU作為一種胸腺嘧啶核苷的類似物像胸腺嘧啶核苷一樣可摻入到細(xì)胞合成的DNA中。當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期而同時又有BrdU存在時,就會有BrdU摻入新合成的DNA中，只要細(xì)胞不消亡，這種BrdU就在胞核的DNA中長期存留。摻入到DNA的BrdU可通過抗BrdU單克隆抗體顯示。該方法能對細(xì)胞周期進(jìn)行迅速而穩(wěn)定的測量,而且標(biāo)記BrdU的細(xì)胞只要不受到紫外線照射，對細(xì)胞本身沒有功能損害。該技術(shù)可應(yīng)用到跟蹤檢測移植細(xì)胞的存活、分化和功能狀態(tài)。（5-Bromo-2-deoxyUridine,5-溴脫氧尿嘧啶核苷)第49頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一Br-dUTPBr-dUTP比生物素/熒光素標(biāo)記的脫氧核苷酸磷酸鹽復(fù)合物、地高辛更容易摻入到凋亡細(xì)胞的DNA中。因?yàn)锽r-dUTP有很強(qiáng)的摻入能力，所以在用熒光素標(biāo)記的抗BrdU單克隆抗體來檢測時，會得到更好的流式細(xì)胞信號。未凋亡的細(xì)胞因?yàn)闆]有暴露的3’未端，所以不會被檢測。第50頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一TUNELAssay第51頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一TUNELAssay第52頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一早早期凋亡的檢測capase3早期凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法早期凋亡線粒體細(xì)胞膜電位的檢測晚期凋亡----“TUNEL”法晚晚期凋亡-----DNA含量分析法第53頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞核，細(xì)胞器及細(xì)胞膜成分，細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生了改變。由于核的改變造成各種熒光染料對凋亡細(xì)胞的DNA可染性發(fā)生改變。其原理為在凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處理時，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。第54頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第55頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白的流式細(xì)胞術(shù)檢測

（1）Fas/FasL(Fas配體)：Fas抗原與Fas配體的交聯(lián)是淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的必需途徑，它們的異常與免疫相關(guān)疾病、腫瘤、移植排斥、病毒性肝炎、腎小球腎炎等多種疾病高度相關(guān)。（2）p53：p53是細(xì)胞周期中的‘檢查點(diǎn)’分子，其控制著細(xì)胞在DNA損傷無法修復(fù)時啟動細(xì)胞的‘自殺’進(jìn)程。p53的缺失或突變已被證明是多種腫瘤（如：乳腺癌、胃腸道腫瘤及肝細(xì)胞癌等）發(fā)生的重要原因。其表達(dá)高低是腫瘤診斷和預(yù)后的重要指標(biāo)。（3）Bcl-2：Bcl-2是細(xì)胞凋亡的抑制蛋白，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療等有著密切關(guān)系。其表達(dá)上調(diào)是腫瘤診斷的指標(biāo)和預(yù)后的參考。第56頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第57頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一多藥耐藥(multidrugresistance,MDR)是由一種藥物誘發(fā)而同時對其它多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的抗癌藥物產(chǎn)生的交叉耐藥，既對廣泛的結(jié)構(gòu)和功能不相同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生的耐藥，導(dǎo)致某些聯(lián)合化療方案失敗。腫瘤多藥耐藥性(multidrugresistanceMDR)檢測第58頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一P170糖蛋白MDR基因編碼的產(chǎn)物P糖蛋白是分子量約為170Kda的胞膜蛋白。P糖蛋白具有一種能量依耐的跨膜藥物外輸泵功能，當(dāng)腫瘤細(xì)胞與抗癌藥物接觸時，脂溶性藥物濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞，而P糖蛋白則結(jié)合藥物分子，同時其ATP結(jié)合位點(diǎn)連上ATP，ATP水解后釋放能量將藥物從胞內(nèi)泵出胞外，藥物在胞內(nèi)濃度不斷下降，其細(xì)胞毒作用因而減弱甚至喪失，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。第59頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一腫瘤細(xì)胞ATPP170糖蛋白抗癌藥物第60頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一用流式細(xì)胞術(shù)檢測人腫瘤組織細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá)產(chǎn)物P170

【摘要】：為研究檢測人腫瘤組織細(xì)胞多藥耐藥基因表達(dá)產(chǎn)物，采用間接標(biāo)記法，用鼠抗人Ｐ１７０單克隆抗體，二抗為ＦＩＴＣ標(biāo)記兔抗鼠Ｉｇ，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測了２９例新鮮實(shí)體腫瘤組織和一株多藥耐藥的Ｋ５６２細(xì)胞株。結(jié)果顯示：１８例腫瘤細(xì)胞表達(dá)Ｐ１７０，其陽性率為６２.１％，１１例未檢出表達(dá)，其陰性率為３７．９％；９９．９％Ｋ５６２細(xì)胞表達(dá)Ｐ１７０。在１８例Ｐ１７０陽性表達(dá)的樣本中，有１６例陽性表達(dá)百分比低于３０％；只有２例高于３０％。提示大多數(shù)腫瘤組織細(xì)胞表達(dá)Ｐ１７０陽性率高，但表達(dá)Ｐ１７０腫瘤細(xì)胞表達(dá)百分比低。檢測腫瘤組織的Ｐ１７０表達(dá)能為臨床治療提供一個可靠的參考指標(biāo)。第61頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一

Fluo-3-Am為一新型的高度特異性Ca2+熒光指示劑，可以靈敏地反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化，F(xiàn)luo-3-Am進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)非特異性酯酶脫去Am酯，成為脂溶的Fluo-3留在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)Fluo-3與細(xì)胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度是Fluo-3本身的40倍以上，當(dāng)用480nm波長激發(fā)時，其熒光強(qiáng)度與游離鈣離子濃度成正比。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測定第62頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一檢測淋巴細(xì)胞引起的細(xì)胞毒作用細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞CTL和自然殺傷細(xì)胞NKC）能釋放包含穿孔素蛋白和顆粒酶的顆?；蛲ㄟ^Fas-Fas連接作用于靶細(xì)胞，引起靶細(xì)胞內(nèi)Caspase酶激增，導(dǎo)致細(xì)胞死亡包括凋亡。具有重大研究和應(yīng)用價值。流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞毒作用(FCC)，利用Caspase專一性熒光底物測定受害細(xì)胞的細(xì)胞毒作用強(qiáng)度。準(zhǔn)確簡便迅速。第63頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一DNA、RNA的測定第64頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一臨床研究淋巴細(xì)胞亞群測定造血干細(xì)胞研究腫瘤相關(guān)基因表達(dá)研究血小板分析白血病和淋巴瘤免疫分型HLA-B27分析PNH診斷第65頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一淋巴細(xì)胞亞群測定淋巴細(xì)胞擔(dān)負(fù)著免疫的主要功能。淋巴細(xì)胞亞群的測定有助于了解機(jī)體免疫狀況及一些疾病的監(jiān)測。臨床經(jīng)常測定的淋巴細(xì)胞亞群包括T淋巴細(xì)胞

(CD3+),T輔助細(xì)胞

(CD3+CD4+),T抑制細(xì)胞(CD3+CD8+),B淋巴細(xì)胞(CD19+或CD20+)，NK細(xì)胞

(CD3-CD56+)等。第66頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一(1)首先用CD3來區(qū)分全部T細(xì)胞。CD3/CD4雙陽性的細(xì)胞為真正的輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞。這些細(xì)胞主要是HIV病毒感染對象。在HIV感染后，隨著疾病的發(fā)展出現(xiàn)免疫抑制后，這群細(xì)胞會明顯減少；在臨床中，對HIV的監(jiān)測主要依靠檢測這群細(xì)胞的數(shù)量.(2)CD3-/CD4+細(xì)胞群體是由單核細(xì)胞組成的。這些細(xì)胞相對于CD4+和T細(xì)胞來說弱表達(dá)CD4，在光散射參數(shù)的位置分布也較廣。CD3/CD4抗體組合能完全將CD4陽性輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞與CD4陽性的單核細(xì)胞區(qū)分開來。因?yàn)镃D4+T細(xì)胞能與單核細(xì)胞完全分離，故在光散射坐標(biāo)上設(shè)淋巴細(xì)胞“門”時，“門”可設(shè)得大一些，即使包含了單核細(xì)胞或其他細(xì)胞都不會影響檢測值。第67頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞表型的檢測淋巴20-25%:T:70%,B:20%,NK:10%;單核2-6%粒細(xì)胞:40-60%第68頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一淋巴細(xì)胞亞群分析淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中執(zhí)行免疫功能的重要細(xì)胞，各種白細(xì)胞分化抗原（CD）分子廣泛分布在T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞。免疫細(xì)胞表面標(biāo)志改變與細(xì)胞的活化和功能的改變有著密切關(guān)系，不同類型免疫細(xì)胞間的比例也對機(jī)體免疫功能具有重要的影響，而這些變化與臨床疾病的病理變化密切相關(guān)。第69頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一PeripheralWhiteBloodCellsCD45+GranulocytesMonocytesEosinophilsBasophilsNeutrophilsLymphocytesTBNKTHelperTCytotoxicCD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD3-CD19+HLA-DR+CD3-CD16+CD56+Monocytes第70頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一AdhesionMetabolic第71頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第72頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一第73頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一T淋巴細(xì)胞T淋巴細(xì)胞檢測淋巴細(xì)胞第74頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一1、Th細(xì)胞：CD3+CD4+CD8-T細(xì)胞，能輔助B細(xì)胞分化成熟,產(chǎn)生抗體,參與促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。（一）淋巴細(xì)胞及其亞群分析第75頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一2、Tc細(xì)胞：

CD3+CD4-CD8+T細(xì)胞，能特異性直接殺傷靶細(xì)胞，所有表達(dá)MHCI類分子的靶細(xì)胞?？鼓[瘤免疫，抗病毒感染，移植排斥反應(yīng)和自身免疫疾病中均起了重要作用。第76頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一B細(xì)胞膜表面免疫球蛋白（Smlg）。表達(dá)CD19、

CD20、CD21、CD22分子。B細(xì)胞也是免疫系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，主要功能是介導(dǎo)體液免疫。(二）B淋巴細(xì)胞及其亞群第77頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一NK細(xì)胞為一組大顆粒的淋巴細(xì)胞，標(biāo)志CD16,CD56,CD2、CD11a/CD18.CD3-CD16+CD56+淋巴細(xì)胞定為NK細(xì)胞。主要功能是參與細(xì)胞免疫，在腫瘤免疫抗病毒感染中均起重要作用。（三）NK細(xì)胞分析第78頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一淋巴細(xì)胞亞群檢測的臨床意義

總T和總B及其亞群的意義總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。對CD4＋和CD8＋T細(xì)胞的測定有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測。

CD4/CD8的意義評價自身免疫失調(diào)、免疫失調(diào)或免疫缺陷病病人的免疫狀態(tài)，（自身免疫病比值升高，病毒感染、腫瘤、再障比值降低）。

NK細(xì)胞的意義

NK（7-40%）細(xì)胞能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。第79頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一HIVANDAIDS第80頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一細(xì)胞內(nèi)因子的檢測第81頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一Th1/Th2細(xì)胞第82頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一PMA（佛波脂）+Ionomycin（依諾霉素）刺激4-6hr流式細(xì)胞細(xì)胞因子分析圖第83頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一

腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)第84頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一P53/Bcl-2第85頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一P53控制著在DNA損失無法修復(fù)時啟動的“自殺”進(jìn)程。P53的缺失或突變已被證明是多種腫瘤發(fā)生的重要原因。它表達(dá)的高低是腫瘤診斷及預(yù)后的重要指標(biāo)。Bcl-2是細(xì)胞凋亡的抑制蛋白，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療等有著密切的關(guān)系。表達(dá)上調(diào)是腫瘤診斷的指標(biāo)和預(yù)后的參考。nm23與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。第86頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一造血干祖細(xì)胞檢測CD34+造血干/祖細(xì)胞的檢測。主要用于干細(xì)胞移植及基因治療方面的檢測。第87頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一上圖中紅色群體是經(jīng)過多參數(shù)設(shè)門后精確設(shè)定的CD34陽性細(xì)胞群體，綠色部分是進(jìn)行定量計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)微球。第88頁，共96頁，2023年，2月20日，星期一