對含油微藻柵藻obtususXJ

/對含油微藻柵藻ｏbtusuｓＸJ—15室外光合自養(yǎng)的兩階段培養(yǎng)法摘要:在這項(xiàng)研究中，柵藻obｔususXJ—15首先從７株微藻（綠藻門柵屬)中選擇，使用兩階段培養(yǎng)的方法，包括I期快速的細(xì)胞生長和Ⅱ期的脂質(zhì)積累。在第一階段中,生物量得率從1３９。4到２１2.1mgL-1d—1。在第二階段，通過加入ＮaCl，脂肪含量由２6.1%提高到４7。7％。這兩個(gè)階段的過程,還實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)在戶外140—L的大規(guī)模培養(yǎng)，在第一階段有86.5mgL—１d－1的生物量得率和１７０。0ｍgＬ－1d-1CO2固定率,和在第二階段的4２。1％高脂質(zhì)含量.根據(jù)這樣的培養(yǎng)方法，總體脂生產(chǎn)率提高,并取得了較好的生物柴油質(zhì)量。這些結(jié)果表明的光合自養(yǎng)兩級系統(tǒng)不僅是可行的，但也有效的。１．?介紹生物柴油已成為越來越有吸引力,由于其潛在的作為一種可持續(xù)和環(huán)境友好型替代品石油衍生的柴油燃料.微藻有希望作為原料用于生產(chǎn)生物柴油，比傳統(tǒng)的陸生作物有較高生長率和光合效。在這些不同種類的富油微藻中，柵藻由于生長快速、易于培養(yǎng)和廣泛適應(yīng)于各種環(huán)境下是研究最多的。此外,該系列菌株經(jīng)常被用于光合作用的CO2和生物柴油產(chǎn)物共還原。不過，在自養(yǎng)并富含營養(yǎng)的生長條件下,柵藻中脂含量僅占干重的８－２8％，不能達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的需要。為了脂質(zhì)的快速積累，微藻培養(yǎng)在生長受限的環(huán)境中，如營養(yǎng)缺乏或高鹽條件下。然而，在這種條件下脂質(zhì)含量提高卻具有相對低的生物量得率，導(dǎo)致整體低脂質(zhì)生產(chǎn)量?？紤]到藻類高生長率與高含脂量的生產(chǎn)通常是相互排斥的。為了解決這個(gè)問題,在第一階段增加生物量密度和在第二階段增加脂質(zhì)積累的兩階段培養(yǎng)法設(shè)想產(chǎn)生,以提高整體脂質(zhì)生產(chǎn)量。大量信息已經(jīng)報(bào)道對光合自養(yǎng)兩階段培養(yǎng)法,即把微藻先在富含氮的培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基中，但是價(jià)格昂貴和操作不簡便。本研究為了提高柵oｂtｕsｕsＸJ-15藻的脂質(zhì)生產(chǎn)力通過直接加入NaCl到培養(yǎng)基中所提出的兩階段的過程,而不是改變培養(yǎng)基，使第二階段更可行,更易于操作。為了進(jìn)一步提高微藻生物柴油的經(jīng)濟(jì)可行性生產(chǎn),在戶外利用太陽能培養(yǎng)藻類是必不可少的。然而，許多藻類菌株不能穩(wěn)定地在戶外生長并且脂類產(chǎn)率比在實(shí)驗(yàn)室低。因此，在室外條件下測試某些藻類的生長的可行性是絕對必要的。在這項(xiàng)研究中，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行戶外。本研究的目的如下:(1)選擇含油量高生產(chǎn)量高的藻株;(2）開發(fā)一個(gè)兩步培養(yǎng)法，以提高油脂生產(chǎn)量；（3）檢查大規(guī)模培養(yǎng)下兩步法培養(yǎng)藻類的可行性.2.?方法2.1生物體本實(shí)驗(yàn)中的六株藻varＸＪ-１，DｅsmodｅsｍuｓoｂtususXJ—３6，D．intermedius，Ｄ。iｎｔermediuｓXJ-１,Ｓ．obtｕsus,Ｄ。abｕndans，S。oｂtuｓusXJ－15由中國水生生物研究所徐東教授提供。室內(nèi)保存培養(yǎng)基:１。５gNａＮO3，40mgK2HPO4,7５mgMgＳO47H2O,2０mgＮa２ＣO３，３6mgCaＣｌ22H2O，６ｍｇamｍｏniumｆｅrriｃcｉtrate,6mｇammoniuｍｃitｒatｅｍonohydrate,1mgEDTＡ,2．86lgH3ＢＯ3，1．81ｌgMnＣl2４H2O，0．22２lgZnSO４7H２O，0。3９lｇNa2ＭoO４2H2O,0。0７9lgCuSO４5H2O，０．050lgCoCl2６H2O在１升水中實(shí)驗(yàn)裝置實(shí)驗(yàn)在北京溫室中１。5升或140升的生物反應(yīng)器時(shí)間為２012年三月到八月白天由氣泵將空氣和%1的二氧化碳混合物提供到反應(yīng)器中，晚上為純空氣,水是自來水。2.2.1菌株的選擇在室內(nèi)BＧ11培養(yǎng)基5升生物反應(yīng)器中培養(yǎng)七株菌，培養(yǎng)12天。攪拌培養(yǎng)。2。2．２5升燒瓶中培養(yǎng)基的優(yōu)化氮源優(yōu)化：NaNO3濃度設(shè)為1.２，1.７,３．4aｎd１0．2mＭ尿素濃度設(shè)為0.８5,1.7，3．4and5。1mM磷濃度優(yōu)化：K2HPO4０。11，０.23，0。34aｎd0。４6ｍM．第二階段氯化鈉濃度：1０，１5,20and25g/l每升、2。2.3大規(guī)模試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)由七月進(jìn)行到八月2。２?計(jì)算2．2.1?生物生產(chǎn)量（ＢP）計(jì)算BP＝（B２－B1）／TB2和B1分別表示Ｔ天后干重和原始干重生物量濃度(BC）BC=229×ＯD6８0(R2＝０。9９6)2.３.3。CＯ2固定速率RCO2＝ＢＰ×ＣＣ×MCＯ2/ＭC３。?結(jié)果和討論3.１藻的選擇在５升燒瓶中室外培養(yǎng)七株淡水微藻（綠藻門、柵藻），通過檢測其生物量得率和脂肪含量來評估它們的油質(zhì)產(chǎn)量。最好的生物量得率是S.obtusuｓ(193.3mgL－1d—１）。最高的脂質(zhì)含量（26．3％）是D。obtｕsusXJ—3６，但它是測試的所有菌株中最少的生物量得率。在一般情況下，生物量高生產(chǎn)率和高脂質(zhì)含量是相互排斥的。最好脂質(zhì)生產(chǎn)者應(yīng)該是生物質(zhì)生產(chǎn)力和脂質(zhì)含量的最佳組合。因此S。oｂtusｕｓXＪ—１5,最高脂質(zhì)生產(chǎn)力42.9ｍgL—1d－1,表現(xiàn)出最佳的生物柴油的潛力并選擇用于后續(xù)試驗(yàn)。３．２兩階段培養(yǎng)Ｓ.oｂtｕsusXJ-１5在５升生物反應(yīng)器3.2.1在第一階段培養(yǎng)基優(yōu)化兩階段過程進(jìn)行培養(yǎng)使Ｓ。obtususXJ－15第一階段中增加的生物量密度，第二階段誘導(dǎo)的脂質(zhì)生產(chǎn)積累。為了最大限度地提高S。ｏbtususXJ-１5的生物量,將培養(yǎng)基事先進(jìn)行了優(yōu)化。氮源對微藻生物量的增加和脂的積累都是非常重要的營養(yǎng)物質(zhì)。作為氮源,氨氣,尿素和硝酸銨通常選擇用于大量培養(yǎng)微藻類。一些藻類物種已經(jīng)報(bào)道了傾向硝酸鈉作為氮源.同時(shí)，尿素也表現(xiàn)出對有利于柵藻的生長。因此，選擇硝酸鈉和尿素檢測S．oｂtusuｓXJ－1５最佳的氮源。表2中總結(jié),使用的硝酸鈉分別為1。2，１。7,3.4和１0。2mＭ時(shí),生物量得率為106。1,1１5。1，13９.411４．9ｍｇL-1d-1１9３。3mｇL—1d—1,用0.85，1.7,3.4和5.1mＭ尿素，生物量得率分別為1４2．１，15１.５，207。9和１8０。４mgL-１d—１.硝酸鈉和尿素在３。4ｍM的濃度表現(xiàn)出對藻類生長的最佳效果。尿素中獲得的最大生物量得率為2070。9ｍgL-１ｄ—1，是在以硝酸鈉為氮源的1．5倍。然而,較高的氮濃度（即10．2ｍgL－1d-1硝酸鹽或5．１ｍｇＬ－１ｄ—1尿素)反而會(huì)使藻類生物質(zhì)生產(chǎn)降低。這可能是由于氮?dú)庠谳^高濃度下對藻類的生長有害。因此，選擇合適的氮源及濃度對某些藻類的快速生長是很重要的.此外,考慮到大規(guī)模培養(yǎng)，尿素是比硝酸鹽更便宜,可以幫助抵抗污染,如原生動(dòng)物和其他藻類。因此，3.4mＭ尿素被認(rèn)為是S.obtususXJ—15的生長合適的氮源和用于隨后的試驗(yàn)。除氮,磷為微藻生長的另一基本組分。使用3．４ｍM尿素介質(zhì),對磷四種濃度進(jìn)行了測試，以規(guī)范Ｓ.obtｕsusＸJ-15的最佳濃度。表2表明，磷表現(xiàn)出類似的行為.在磷濃度從0.1２增加到0.34mM導(dǎo)致生物量生產(chǎn)效率的增加，從1３9.3ｍgL－1d—1至21２．１ｍｇL-1d-1，在磷濃度進(jìn)一步增加導(dǎo)致了生物量得率顯著下降。這一結(jié)果表明，0.３4mM磷是對S．obtｕsｕsXJ-15的增長最佳濃度。值得注意的是，培養(yǎng)基和方法對特定菌株的培養(yǎng)是很重要的.兩者合計(jì)，３．４ｍM尿素作為氮源伴隨０.３４ｍM磷是為S.obtususXJ—15生長的最佳培養(yǎng)基，而這最佳培養(yǎng)基用于后續(xù)試驗(yàn)。３.2.2。在第二階段的脂質(zhì)誘導(dǎo)最近，一些研究主要集中在鹽作為一種有效的刺激使淡水微藻柵更好的脂質(zhì)堆積.此外,氯化鈉是相對便宜和容易獲得的。因此，我們選擇它作為本研究的第二階段中脂誘導(dǎo)劑.當(dāng)藻類生長到了后期指數(shù)階段，4種濃度的NａＣｌ加入到培養(yǎng)基中。圖1為隨著時(shí)間進(jìn)程S.ｏbtｕsｕs增加XＪ－１5的生長和脂質(zhì)含量兩階段培養(yǎng)過程中的變化;獲得的生長和脂質(zhì)參數(shù)總結(jié)在表3。在單批培養(yǎng)的第二階段,生物量濃度從2。1提高到3。0g／ｌ和脂質(zhì)的含量從2６。1％提高到３５.3％.而在第二階段的培養(yǎng),在ＮaＣl濃度的增加導(dǎo)致生物質(zhì)生產(chǎn)率降低而脂質(zhì)含量（表３)。脂質(zhì)在所有的NａCｌ濃度比單級批培養(yǎng)具有較高的含量(圖１).藻細(xì)胞在２5g／l氯化鈉中取得了最高的脂質(zhì)含量,但在第二階段后四天,他們不久后死亡（圖1）。這可能是因?yàn)閷Γ?。obtｕｓusXJ－15超過對鹽度的忍受度。其中幸存的藻中,脂質(zhì)含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的上漲,在20g/l氯化鈉培養(yǎng)８天后達(dá)到了最大脂含量47.7％。從表4中可以看出我們研究的這株藻最大脂含量比其它柵藻類在同樣的高鹽條件下達(dá)到的脂含量要高。雖然對于在NａCl加入培養(yǎng)基中，細(xì)胞總脂質(zhì)含量積累的機(jī)制是不清楚，可能是提高極性和中性脂質(zhì)的產(chǎn)率和甘油，它可以幫助生物體忍受高鹽度.例如，極性脂質(zhì)的增加可以降低膜的滲透性和流動(dòng)性，從而有可能避免鈉離子和氯離子過量進(jìn)入細(xì)胞。中性脂肪含量較高也可以幫助微藻細(xì)胞通過提高膜的硬度抵抗?jié)B透壓。至于其它鹽的效果，碳酸氫鈉可以通過提高光合效率和硝酸鹽利用使微藻細(xì)胞增加脂質(zhì)含量。然而，其效果在我們所研究的這株藻中沒有氯化鈉效果明顯。其它鹽，如氯化鐵，鉻，銅和鋅的鹽，也已發(fā)現(xiàn)可以增加一些微藻的脂質(zhì)含量,但它們會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境危害所以不能廣泛使用.相對比，氯化鈉補(bǔ)充的方法是更有效和更安全的,特別是考慮到成本，可用性和再循環(huán)等特點(diǎn)。通過兩階段培養(yǎng)法，加入20g/l氯化鈉后，脂質(zhì)生產(chǎn)力提高到60.7mgＬ－１d-1比沒有加氯化鈉的藻(脂生產(chǎn)力為5１.3mgL-1d－1)高1.2倍。（表3)，比以前傳統(tǒng)的單級分批培養(yǎng)4２.9ｍgL－1ｄ-１高了1.4倍(的表1）.這個(gè)最大的脂質(zhì)生產(chǎn)力比大多數(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道值的更高。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)S。oｂtususＸJ-1５通過兩階段培養(yǎng)法所產(chǎn)生生物柴油質(zhì)量,該實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對脂肪組分進(jìn)行分析。ＣN被廣泛用作相關(guān)的點(diǎn)火延遲時(shí)間和燃燒品質(zhì)的柴油燃料品質(zhì)參數(shù)。越高CＮ是,其點(diǎn)火性能更好.通過表5可以看過通過兩階段培養(yǎng)所獲得的油脂質(zhì)量更好。IV表示不飽和脂肪酸含量，其含量越高，油脂質(zhì)量越不好,標(biāo)準(zhǔn)不能超過１2０，本研究所用的藻通過單培養(yǎng)和兩階段培養(yǎng)所獲得的油脂都達(dá)準(zhǔn)，并且通過兩階段培養(yǎng)獲得的油脂IV值要更低，因此油質(zhì)更好。CＦPP表示低溫下油脂的流動(dòng)性，可以看出加與不加氯化鈉對這項(xiàng)指標(biāo)影響不大,都符合標(biāo)準(zhǔn)。因此,Ｓ.obtｕｓusXＪ-15是有希望的原料生產(chǎn)生物柴油。加入NaCl生物柴油的質(zhì)量有了改善。兩者合計(jì)，兩階段培養(yǎng)不僅可行而且有效得多。3．3。在兩階段過程中大面積種植的可行性為了檢查大規(guī)模條件下兩階段培養(yǎng)的可行性,S。obtusuｓXJ—１５接種到用上述最佳培養(yǎng)基的1４０－L的氣泡柱。如圖2，第一階段細(xì)胞在前15天快速長大,達(dá)到1.5g/l的最高生物量密度，生物量得率為86。5mgＬ—1ｄ—1g/l相當(dāng)于21。4gm-2ｄay－1。此生產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于相關(guān)的研究，這是報(bào)道的高得多,在露天池塘微藻冬凌草S．生物物質(zhì)生產(chǎn)力為4．6gｍ-2ｄａｙ—１，S。biｊuga為８。1gm-2ｄaｙ-1的平均生產(chǎn)力。此外，ＣＯ2的固色率在第一階段為17０.０mg表6），這比在Euｇl埃納纖細(xì)的戶外培養(yǎng)高出2倍。該實(shí)驗(yàn)第二階段為更好的脂質(zhì)積聚,應(yīng)該在1６天的晚期指數(shù)期進(jìn)行。然而,天氣突然下雨，持續(xù)了數(shù)天（圖3）。在這種天氣下，生物質(zhì)的高密度對于在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)是致死的,因?yàn)閮?nèi)部細(xì)胞由于被遮擋幾乎接觸不到陽光,并且隨后的生物污染(即纖毛蟲和原生動(dòng)物）容易發(fā)生,特別是當(dāng)細(xì)胞生命活力不高時(shí)。因此，我們收集三分之一的生物量并補(bǔ)充相同體積的新鮮培養(yǎng)基中（圖2）.當(dāng)天氣放晴，我們添加氯化鈉,如圖２，誘導(dǎo)前,脂質(zhì)含量為３０.8％。后經(jīng)過第二階段8天誘導(dǎo),脂質(zhì)含量增加至42．１%。而在整個(gè)期間（包括陰雨天）的總脂產(chǎn)量為２３．２mgL－1d-1,約為已報(bào)道的1。6倍。因此，Ｓ．obtusｕsXJ—１５成功地實(shí)現(xiàn)了在大規(guī)模和甚至在高細(xì)胞密度兩階段過程，并在不同的室外環(huán)境條件下生長良好?？傊?S．obtuｓusＸＪ—15