蛋白質(zhì)相互作用技術研究的幾種技術

蛋白質(zhì)相互作用研究技術

匯報人:布沙熱木.阿布力孜瑪伊熱.努熱艾合買提夏尤普.玉蘇甫阿布力米提.莫明現(xiàn)在是1頁\一共有19頁\編輯于星期五酵母雙雜交谷胱苷肽-S-轉移酶沉淀試驗(GST-pulldown）免疫共沉淀雙分子熒光互補技術(BIFC)生物發(fā)光共振能量轉移（ＢＲＥＴ）技術常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術現(xiàn)在是2頁\一共有19頁\編輯于星期五一、細菌雙雜交系統(tǒng)

Two-hybridsystem是90年代初發(fā)展起來的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)（targetprotein）相互作用的基因?；驹恚?/p>

真核生物的轉錄因子大多是由兩個結構上分開、功能上獨立的結構域組成的,如GAL4（酵母轉錄激活蛋白Gal4的基因）。這兩個結構域各具功能，互不影響。但一個完整的激活特定基因表達的激活因子必須同時含有這兩個結構域，否則無法完成激活功能?，F(xiàn)在是3頁\一共有19頁\編輯于星期五

酵母激活因子GAL4：N端：147個氨基酸組成的DNA結合域(BD)，C端：113個氨基酸組成的轉錄激活域(AD)。GAL4分子的DNA結合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，而轉錄激活域則能激活UAS下游的基因進行轉錄。組成部分：（1）與BD融合的蛋白表達載體，被表達的蛋白稱誘餌蛋白（bait）；（2）與AD融合的蛋白表達載體，被其表達的蛋白稱靶蛋白（prey）；（3）帶由一個或多個報告基因的宿主菌株。

現(xiàn)在是4頁\一共有19頁\編輯于星期五現(xiàn)在是5頁\一共有19頁\編輯于星期五BDACOOHADBNH2

COOH共轉化+BDAADGal4Gal4PromoterReporterNH2Gal4Gal4B現(xiàn)在是6頁\一共有19頁\編輯于星期五酵母雙雜交基本過程舉例現(xiàn)在是7頁\一共有19頁\編輯于星期五二、谷胱苷肽-S-轉移酶沉淀試驗

(GST-pulldown）原理GST-融合蛋白GSTXY谷胱甘肽-瓊脂糖球珠細胞裂解物

tube4℃下孵育2h

GSTXY+現(xiàn)在是8頁\一共有19頁\編輯于星期五GSTpulldown實驗流程（1）

Glutathione瓊脂糖珠預處理。（2）GST融合蛋白掛柱：取適量GST-融合蛋白與10μl已經(jīng)處理過的beads置于1.5ml離心管中，4℃,搖床孵育過夜。（3）孵育過夜的蛋白質(zhì)與beads的混合液于4℃,500g離心5min，上清收集，觀察融合蛋白是否飽和地掛在beads上，用1ml冰冷的細胞裂解緩沖液洗三次beads。（4）將菌體用溶菌酶處理，之后破碎細菌壁，最大轉速4℃離心20min,收集上清液。（5）將細胞裂解液上清加入beads中，混勻，4℃，搖床3h。（6）3h后，用冰冷的細胞裂解緩沖液洗三次。（7）加15μl2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min.（8）SDS,WesternBlot或質(zhì)譜儀分析。現(xiàn)在是9頁\一共有19頁\編輯于星期五免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。當用預先固化在argarosebeads上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。三、免疫共沉淀原理現(xiàn)在是10頁\一共有19頁\編輯于星期五三、免疫共沉淀原理現(xiàn)在是11頁\一共有19頁\編輯于星期五免疫共沉淀實驗流程（1）將菌體用溶菌酶處理，冰上裂解30min,之后破碎細菌壁，最大轉速4℃離心30min,收集上清液。冰上裂解30min,（2）取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液加1μg相應的抗體加入到細菌裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜。（3）取10μlproteinA瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3,000rpm離心3min。（4）將預處理過的10μlproteinA瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與proteinA瓊脂糖珠偶連。（5）免疫沉淀反應后，在4°C以3,000rpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底。將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次。最后加入15μl的2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5分鐘。（6）SDS,Westernblotting或質(zhì)譜儀分析.現(xiàn)在是12頁\一共有19頁\編輯于星期五四、雙分子熒光互補技術(bimolecular

fluorescencecomplementation,BIFC)

BiFC技術是將熒光蛋白（GFP、YFP、CFP）分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接。如果兩個目標蛋白因為有相互作用而接近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因而發(fā)出熒光。在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，對研究蛋白質(zhì)相互作用有重要意義。

現(xiàn)在是13頁\一共有19頁\編輯于星期五現(xiàn)在是14頁\一共有19頁\編輯于星期五BIFC的優(yōu)勢

在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用的蛋白發(fā)生的時間、位置、強弱、所形成蛋白復合物的穩(wěn)定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等?，F(xiàn)在是15頁\一共有19頁\編輯于星期五五、生物發(fā)光共振能量轉移（ＢＲＥＴ）技術

ＢＲＥＴ技術是近年來出現(xiàn)的一種新的檢測蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的技術。是建立在非輻射能量轉移的基礎上，在一個發(fā)光或熒光供體發(fā)光酶（lux）和一個熒光受體（如綠色熒光蛋白GＦＰ）之間會發(fā)生能量轉移。供體發(fā)光酶在相應底物存在時發(fā)射光波。能量受體是熒光蛋白，在一定波長范圍內(nèi)吸收光波，并在一定的波長范圍內(nèi)發(fā)射光波。將兩個目的蛋白分別和供體和受體形成融合蛋白，兩個目的蛋白之間距離足夠近并發(fā)生相互作用，即可檢測到ＢＲＥＴ信號。現(xiàn)在是16頁\一共有19頁\編輯于星期五現(xiàn)在是17頁\一共有19頁\編輯于星期五蛋白質(zhì)之間相互作用以