植物細胞工程基本原理

植物細胞工程基本原理第1頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五2.1植物細胞全能性(totipotent)在離體培養(yǎng)下，植物的體細胞或性細胞被誘導(dǎo)產(chǎn)生器官分化和再生，成為具有與母體植株相同遺傳信息的植株的能力。植物細胞全能性的相對性不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng)；動、植物細胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯差異。細胞全能性并不意味著任何細胞均可以直接產(chǎn)生植物個體。第2頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五2.2植物細胞分化基因的差異性表達，即為細胞分化；具體表現(xiàn)為內(nèi)部生理變化和外部形態(tài)變化。細胞分化使細胞功能趨于專門化，更有利于提高生理功能的效率。因此,分化是進化的表現(xiàn),越高級的植物類群,分化水平越高,細胞分工越細,機體代謝水平也越高。第3頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五2.3離體條件下植物細胞的脫分化和再分化細胞脫分化和再分化的概念細胞全能性與脫分化和再分化的關(guān)系第4頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五細胞脫分化（dedifferentiation)是指失去已分化細胞的典型特征，或消除了細胞分工，使之回復(fù)到分生組織狀態(tài)，或胚性細胞狀態(tài)。Flash細胞脫分化階段 啟動階段，表現(xiàn)為細胞質(zhì)增生，并開始向細胞中央伸出細胞質(zhì)絲，液泡蛋白體出現(xiàn)； 演變階段，此時細胞核開始向中央移動，質(zhì)體演變成原質(zhì)體； 脫分化終結(jié)期，細胞回復(fù)到分生細胞狀態(tài)，細胞分裂即將開始。一個植物細胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進行的程度，取決于它在自然部位上所處的位置和生理狀態(tài)。第5頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五第6頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五第7頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五愈傷組織(callus)：脫分化后的細胞，往往經(jīng)過細胞分裂形成一團無特定結(jié)構(gòu)和功能的松散的薄壁細胞團。草莓煙草第8頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五細胞再分化（redifferentiation)：脫分化后的分生細胞（愈傷組織）在特定的條件下，重新恢復(fù)細胞分化能力，并經(jīng)歷器官發(fā)生形成單極性的芽或根，或經(jīng)歷胚胎發(fā)生形成雙極性的胚狀體，進一步發(fā)育成完整植物體的過程。極性：是指植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。

在很多情況下，細胞的不均等分裂是細胞極性建立的標(biāo)志。第9頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五細胞全能性脫分化再分化個體再生細胞全能性的表達是通過細胞脫分化和再分化實現(xiàn)的，在大多數(shù)情況下，脫分化是細胞全能性表達的前提，再分化是細胞全能性表達的最終體現(xiàn)。細胞分裂細胞全能性與脫分化和再分化的關(guān)系第10頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五器官發(fā)生植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根（adventitiousroots）、不定芽（adventitiousshoots）等器官的過程。通過器官發(fā)生形成再生植株有三種方式：第11頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五先芽后根第12頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五先根后芽第13頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株。第14頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五植株再生兩種途徑：器官發(fā)生途徑:根芽器官直接分化形成植株體細胞胚胎發(fā)生途徑:產(chǎn)生具有胚芽、胚根的胚狀體結(jié)構(gòu)再形成植株第15頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五植物體細胞胚胎發(fā)生胚狀體：（embryoid）亦稱體細胞胚或體胚。在體外，由體細胞（非合子細胞）經(jīng)胚胎發(fā)育產(chǎn)生的類似胚胎的結(jié)構(gòu)。其發(fā)育過程與合子胚類似，經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚及子葉胚等幾個階段。在其發(fā)生的最早階段就具有兩極性，即根端（胚根）和莖端（胚芽），并且與母體細胞或外植體的維管束無直接聯(lián)系胚狀體一開始就是一個完整植物的雛形，可通過根端或類似胚柄結(jié)構(gòu)從外植體或愈傷組織中取得營養(yǎng)。很容易從愈傷組織的表面脫離下來，在適宜條件下長成一株植物。第16頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五魔芋體細胞胚魔芋第17頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五如何鑒別胚狀體？（I）與器官發(fā)生形成個體的途徑相比：

胚狀體具雙極性（doublepolarity）生理隔離（physiologicalisolation）遺傳性相對穩(wěn)定 由于大多數(shù)體細胞胚起源于單細胞，因此對于單個植株來講，通過體細胞胚形成的再生植株，其遺傳特性相對穩(wěn)定。重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特性。第18頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五如何鑒別胚狀體？（II）與合子胚相比：合子胚在發(fā)育初期具有明顯胚柄，體細胞胚沒有真正的胚柄合子胚的子葉是相當(dāng)規(guī)范的，要以作為分類的依據(jù)，而體細胞胚的子葉常不規(guī)范，有時具有兩片以上的子葉與相同植物相比，體細胞胚體積明顯小于合子胚體細胞胚沒有休眠，而合子胚胚胎發(fā)育完全進入子葉期以后，經(jīng)過一系列的物質(zhì)積累和脫水就進入休眠。第19頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五類似于動物胚胎早期的發(fā)育胚胎細胞發(fā)生發(fā)育早期2次均等分裂胚結(jié)構(gòu)形成第20頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五體細胞胚胎發(fā)生途徑胚狀體可從離體培養(yǎng)的各種外植體上直接或間接地發(fā)生，大致分為五種：直接從器官外植體上發(fā)生(以葉片為例）愈傷組織發(fā)生懸浮培養(yǎng)細胞發(fā)生單倍體細胞發(fā)生原生質(zhì)體發(fā)生第21頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五體細胞胚胎發(fā)生途徑1：葉片

誘導(dǎo)階段胚胎發(fā)育階段(蘭草,Chen等,1999)蘭草第22頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五體細胞胚胎發(fā)生途徑2：愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織形成愈傷組織胚性化球形胚形成子葉胚期蝴蝶蘭,Lin等,2000第23頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五蝴蝶蘭第24頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五體細胞胚胎發(fā)生途徑3：（懸浮細胞）發(fā)生過程：胚性細胞團轉(zhuǎn)移到適宜的胚胎發(fā)生培養(yǎng)基上以后，其外圍的許多細胞開始不均等分裂，靠近細胞團方向的一個細胞較大，以后發(fā)育成類似胚柄的結(jié)構(gòu)。另一個細胞則繼續(xù)分裂形成類似原胚的結(jié)構(gòu)，以后經(jīng)過類似于體內(nèi)的發(fā)育過程，經(jīng)球形期、心形期等發(fā)育階段形成完整的體細胞胚。懸浮液中有兩類細胞：

不具備胚胎發(fā)生潛力（自由分散、大、高度液泡化）

具備成胚能力的胚性細胞團（成簇成團、小、胞質(zhì)致密）第25頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五懸浮細胞體細胞胚發(fā)生過程愈傷組織胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)的胚性細胞團球形胚形成成熟子葉胚第26頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五影響體細胞胚發(fā)生的因素1.生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

(1)生長素類:

(例）在離體條件下胡蘿卜體細胞胚的發(fā)育是一個包括兩個步驟的過程,每個步驟需要一種不同的培養(yǎng)基。愈傷組織的建立和增殖所需要的是一種含有生長素的培養(yǎng)基，通常所用的生長素是2,4-D,濃度范圍0.5～1mg/L。在這樣一種培養(yǎng)上,愈傷組織的若干部位分化形成分生細胞團,稱作“胚性細胞團”。在增殖培養(yǎng)基上反復(fù)繼代,胚性細胞團的數(shù)量不斷增加,但并不出現(xiàn)成熟的胚。然而,如果把胚性細胞團轉(zhuǎn)移到一種生長素含量很低或完全沒有生長素的培養(yǎng)上,它們就能發(fā)育為成熟的胚。

第27頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五(2)細胞分裂素類:

既或促進也可抑制體細胞胚的發(fā)生,這主要取決于植物的種類及其基因型。一般而言,細胞分裂素對于促進體細胞胚的成熟有顯著作用,特別有利于子葉的發(fā)育。另外有研究表明,不同的外植體對于細胞分裂素的需要可能具有不同的專一性,如在胡蘿卜的研究中發(fā)現(xiàn),雖然激動素對胚胎發(fā)生過程表現(xiàn)抑制作用,但濃度為0.1μM的玉米素卻能促進這個過程,而6-BA對胡蘿卜則是促進其愈傷組織的增殖,但不形成胚性愈傷組織。第28頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五(3)赤霉素類:

赤霉素類能抑制體細胞胚胎發(fā)生,但對于許多植物而言,赤霉素對于體細胞胚的成熟與萌發(fā)有促進作用。(4)脫落酸:

抑制劑特別是ABA,在體細胞胚發(fā)生過程中的作用正逐漸被提示出來,ABA是一種天然產(chǎn)生的生長調(diào)節(jié)劑,當(dāng)把無抑制作用劑量(通常是0.1～1μM)的ABA用于荷蘭芹屬培養(yǎng)物時,可以允許胚成熟過程進行。但是其抑制不定胚的啟動。小麥、石刁柏、顛茄則要在適當(dāng)濃度的生長素和較高濃度的激動素時才能分化出胚狀體第29頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五石刁柏顛茄第30頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五2.氮源氮源有還原態(tài)氮(NH4+)和氧化態(tài)氮(NO3-)兩種在以KNO3為唯一氮源(如White培養(yǎng)基)的培養(yǎng)上建立起來的愈傷組織,去掉生長素以后不能形成胚。

德國Reinert等在栽培胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中(培養(yǎng)基均為White培養(yǎng)基)得到以下結(jié)果:[NH4+](mM)[NO3-](mM)體胚發(fā)生數(shù)(個/2ml)10401131±21905519±0.309511.3±4.1第31頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五3.低溫預(yù)處理低溫(3℃）對四季橘花粉胚形成的影響處理時間（天）培養(yǎng)花粉花胚狀體（枚）(個)(％)084880.945723121.6610902151.661584650.592047020.432543430.69第32頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五4.植物的遺傳性一個離體培養(yǎng)的煙草花藥，可以產(chǎn)生200個體細胞胚。花藥培養(yǎng)中胚狀體誘導(dǎo)率比較誘導(dǎo)率（％）煙草>30柑桔0.43%~1.66%白菜1.1%~1.68%第33頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五蘋果品種間花藥培養(yǎng)胚狀體發(fā)生頻率比較品種發(fā)生頻率（％）元帥1.9%~2.5%國光0.0%~1.2%金冠0.2%~3.4%赤陽0.3%~1.5%第34頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五生理狀態(tài)對體細胞胚形成的影響第35頁，共36頁，2023年，2月20日，星期五生理狀態(tài)對體細胞胚形成的影響如毛果楊花藥誘導(dǎo)在不同年