檢測(cè)技術(shù)方法

檢測(cè)技術(shù)方法第1頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五免疫測(cè)定的發(fā)展（1）以抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)所致的沉淀或凝集現(xiàn)象判斷結(jié)果的免疫測(cè)定技術(shù)，如單雙擴(kuò)，免疫電泳，玻片凝集，膠乳凝集，紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)等；（2）固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，如放射免疫試驗(yàn)，酶免疫試驗(yàn)，熒光免疫試驗(yàn)等；（3）均相免疫測(cè)定技術(shù)，如酶放大免疫測(cè)定技術(shù)（EMIT），克隆酶供體免疫測(cè)定（CEDIA）等；（4）以單克隆抗體為基礎(chǔ)的免疫測(cè)定技術(shù)的發(fā)展；（5）以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的免疫測(cè)定技術(shù)發(fā)展時(shí)期；（6）免疫測(cè)定的自動(dòng)化；（7）生物芯片技術(shù)（免疫測(cè)定的集成化和微型化）。第2頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五如何區(qū)分不同的檢測(cè)方法以抗原抗體特異結(jié)合為基礎(chǔ)，以標(biāo)記示蹤物不同劃分放射免疫法酶聯(lián)免疫法化學(xué)發(fā)光法時(shí)間分辨法免疫層析法第3頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫（ELISA）

基礎(chǔ)知識(shí)第4頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五免疫檢測(cè)的基礎(chǔ)知識(shí)

1.1

抗原

抗原是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖M(jìn)入機(jī)體后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和引起細(xì)胞免疫。在免疫測(cè)定中，抗原是指能與抗體結(jié)合的物質(zhì)。能在機(jī)體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質(zhì)，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。第5頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五免疫檢測(cè)的基礎(chǔ)知識(shí)

1.1抗原

小分子化合物在與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合后能引起機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的，稱(chēng)為半抗原（hapten）。例如某些激素、藥物等?？乖姆磻?yīng)性取決于抗原決定簇（antigenicdeterminant），或稱(chēng)為表位（epitope）。一個(gè)抗原分子可帶有不同的決定簇，例如中可帶有等決定簇。第6頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.2抗體1.2.1抗體的結(jié)構(gòu)

抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類(lèi)，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測(cè)定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。免疫檢測(cè)的基礎(chǔ)知識(shí)

第7頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類(lèi)型。在均相EIA中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測(cè)定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對(duì)底物作用的活力，因而測(cè)出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。第8頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法均相EIA在臨床檢驗(yàn)中較少應(yīng)用。非均相EIA需先進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbentassay），簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA，第9頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五第10頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五2023/4/11酶聯(lián)免疫法

ELISA的原理

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。第11頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法

ELISA的原理

在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。第12頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法

ELISA的原理

此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。第13頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法ELISA的類(lèi)型

ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為“結(jié)合物”；（3）酶反應(yīng)的底物。第14頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶聯(lián)免疫法ELISA的類(lèi)型

根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要

有以下幾種類(lèi)型：第15頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五ELISA檢測(cè)方法根據(jù)標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法。常用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類(lèi)型：夾心法間接法競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法第16頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五夾心法雙抗原（抗體）夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，其檢測(cè)方法：雙抗原夾心：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)抗原Ag*→Ag-Ab-Ag*+底物(TMB)→顯色雙抗體夾心：固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標(biāo)抗體Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色第17頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五雙抗原夾心法示意圖+Y+Y抗原特異性抗體（IgG、IgM）金標(biāo)抗原顯色第18頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下：

1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。

4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。第19頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五夾心法圖解TMB+H2O2TMB+H2O2顯色樣品酶標(biāo)抗原加樣洗滌加酶包被底物包被抗原21114233360’30’30’45554洗滌一步法二步法第20頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五ELISA的測(cè)定模式雙抗體夾心法測(cè)抗原

第21頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五間接法間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗

體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法第22頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五間接法圖解TMB+H2O2顯色樣品酶標(biāo)二抗洗滌加樣包被底物包被抗原加酶洗滌143215234530’30’10’第23頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五間接法測(cè)抗體第24頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五間接法第25頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五競(jìng)爭(zhēng)法第26頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體第27頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五TMB+H2O2TMB+H2O2競(jìng)爭(zhēng)法圖解顯色酶標(biāo)抗體加樣包被底物包被抗原加酶洗滌14321360’10’22134樣品4第28頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五捕獲法第29頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五固相捕獲法測(cè)IgM抗體第30頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五ELISA試劑盒組分完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液。第31頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶標(biāo)板固相載體固相載體在ELISA測(cè)定過(guò)程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性，加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。第32頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五包被的方式將抗原或抗體固定在過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)。包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過(guò)程。第33頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五包被用抗原用于包被固相載體的抗原按其來(lái)源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。

第34頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五包被用抗體包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。第35頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五包被的條件包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定。第36頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程?？乖蚩贵w

包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。第37頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五結(jié)合物結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤?，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。第38頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)

定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。HRP(辣根過(guò)氧化物酶)AP(堿性磷酸酶)第39頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五結(jié)合物的制備（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)

它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。第40頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五結(jié)合物的制備（2）過(guò)碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過(guò)氧化物酶的標(biāo)記常用

此法。反應(yīng)時(shí)，過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。第41頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五結(jié)合物的保存酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過(guò)程中引起活力的減低，而且使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長(zhǎng)時(shí)間保存。第42頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五結(jié)合物的稀釋液用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì),通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)以抑制結(jié)合物的吸附。第43頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶的底物HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，過(guò)氧化物為H2O2，四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)第44頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五洗滌液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水第45頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶反應(yīng)終止液常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式

ELISA中一般采用2mol/L第46頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品陽(yáng)性對(duì)照品(positivecontrol)和陰性對(duì)照品(negativecontrol)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控

制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照，因此對(duì)照品，特別是陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。第47頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用

的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。第48頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五ELISA的操作要點(diǎn)優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條

件。第49頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五標(biāo)本的采取和保存可用作ELISA測(cè)定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進(jìn)行測(cè)定（如血清、尿液），有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測(cè)均以血清為標(biāo)本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中均以血清作為檢測(cè)標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。第50頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五標(biāo)本的采取和保存清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。

一般說(shuō)來(lái)，在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過(guò)一周測(cè)定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過(guò)濾，澄清后再檢測(cè)。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時(shí)就應(yīng)注意無(wú)菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑（見(jiàn)3.2.4）。第51頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五試劑的準(zhǔn)備按試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗(yàn)不需用的部分應(yīng)及時(shí)放回冰箱保存。第52頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五加樣在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。

加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測(cè)定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時(shí)可用定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。第53頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五溫育在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)，第54頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五溫育ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。第55頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五溫育溫度37度43度？時(shí)間30分鐘60分鐘？環(huán)境水浴空氣??？第56頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五洗滌洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。第57頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五顯色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。第58頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五測(cè)量酶標(biāo)儀第59頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五質(zhì)量控制質(zhì)量控制（QuailityControl,Q.C）

質(zhì)量控制是監(jiān)視全過(guò)程，排除誤差，防止變化，維持標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀的一個(gè)管理過(guò)程。這一過(guò)程是通過(guò)一個(gè)反饋環(huán)路進(jìn)行的。

1）確定控制的對(duì)象；

2）規(guī)定控制對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)（預(yù)期值）；

3）制定或選擇控制方法和手段；

3）測(cè)量實(shí)際數(shù)據(jù)；

4）比較或較對(duì)實(shí)際數(shù)據(jù)與預(yù)期值之間的差異，并說(shuō)明產(chǎn)生這一差異的原因。超出預(yù)定誤差范圍，報(bào)警系發(fā)出信號(hào)，反饋通道中斷。

5）采取行動(dòng)，解決差異?；謴?fù)原狀（原標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)）的手段發(fā)揮作用。第60頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五誤差實(shí)驗(yàn)誤差分為三種：系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差和過(guò)失誤差。

系統(tǒng)誤差是指一系列測(cè)定結(jié)果與真值或靶值存在有同一傾向的誤差，有明顯的規(guī)律性，可在一定條件下重復(fù)出現(xiàn)，是可以通過(guò)質(zhì)控預(yù)防和校正的。

隨機(jī)誤差又稱(chēng)偶然誤差，是一種偶然的、未能預(yù)料到的誤差，是難以避免和校正的誤差。檢驗(yàn)工作中隨機(jī)誤差的分布符合正態(tài)分布規(guī)律。

過(guò)失誤差是人為的責(zé)任誤差。通過(guò)加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室管理和開(kāi)展質(zhì)量控制工作是可以避免的。第61頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五真值用確切的、最理想的決定性方法測(cè)得的值，稱(chēng)為真值。真值一般是測(cè)不到的。通過(guò)可靠的決定性方法測(cè)出的值，稱(chēng)為靶值，通常用靶值來(lái)表示真值的大小。第62頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五準(zhǔn)確度是指測(cè)定結(jié)果與真值（或靶值）接近的程度。準(zhǔn)確度不能以數(shù)字表示，往往用不準(zhǔn)確度來(lái)衡量。測(cè)定結(jié)果與靶值的偏離程度稱(chēng)為偏差，它表示該項(xiàng)檢驗(yàn)的不準(zhǔn)確度。

絕對(duì)偏差=檢驗(yàn)的均值-真值（或靶值）

相對(duì)偏差=絕對(duì)偏差真值÷（或靶值）×100%第63頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五精密度

是指對(duì)同一樣本重復(fù)測(cè)定時(shí)，每次測(cè)定結(jié)果與平均值的接近程度，即重復(fù)測(cè)定值之間的符合程度。第64頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五標(biāo)準(zhǔn)品1、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的，用肯定的、公認(rèn)的、準(zhǔn)確的物理或化學(xué)方法測(cè)定的定值材料。

2、國(guó)際生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的國(guó)際活性單位的材料。

3、參考標(biāo)準(zhǔn)血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化組織根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的法定材料?？捎糜阼b定儀器和鑒定方法準(zhǔn)確性。第65頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五質(zhì)量控制血清質(zhì)控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗(yàn)中加入一份或數(shù)份，通過(guò)所得結(jié)果來(lái)了解本次檢驗(yàn)的情況。質(zhì)控血清檢驗(yàn)的結(jié)果如能控制其誤差在一定范圍內(nèi)，就說(shuō)明該檢驗(yàn)沒(méi)有發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過(guò)允許誤差范圍的異常結(jié)果，提示該檢驗(yàn)不合格，應(yīng)尋找原因，糾正后，重檢待測(cè)標(biāo)本。因此質(zhì)控血清在質(zhì)控工作中起重要作用。第66頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五室內(nèi)質(zhì)量控制程序臨床檢驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，每次或每天之間不可能沒(méi)有誤差。決定允許的誤差范圍，以臨床上不造成誤診與漏診為準(zhǔn)，通過(guò)以下步驟來(lái)確定質(zhì)控范圍。

1）最佳條件下的測(cè)定誤差。

2）已知值的血清在常規(guī)檢驗(yàn)條件下的誤差。

3）未知值的血清在常規(guī)檢驗(yàn)條件下的誤差。

4）臨床應(yīng)用的要求。對(duì)任何一個(gè)試驗(yàn)都應(yīng)確定一個(gè)允許的誤差范圍，前題是滿(mǎn)足臨床要求。如允許誤差定得過(guò)小，在臨床上不存在任何意義，但為了符合該規(guī)定卻要花費(fèi)很大人力、物力和時(shí)間。相反，如果將允許誤差定得過(guò)大，將使監(jiān)測(cè)系統(tǒng)察覺(jué)不到臨床上要求檢出的誤差，失去質(zhì)控的意義。第67頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五輔助材料生物活性材料稱(chēng)量包被液/封閉液配制包被/封閉微孔板干燥微孔板真空包裝微孔板其他組分配制液體分裝檢驗(yàn)檢驗(yàn)檢驗(yàn)檢驗(yàn)標(biāo)簽粘貼試劑盒組裝試劑盒入庫(kù)說(shuō)明一般生產(chǎn)區(qū)十萬(wàn)級(jí)潔凈區(qū)質(zhì)控點(diǎn)質(zhì)控要點(diǎn)1質(zhì)控要點(diǎn)2質(zhì)控要點(diǎn)3質(zhì)控要點(diǎn)4第68頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五酶免疫測(cè)定操作中的注意事項(xiàng)標(biāo)本的收集和保存試劑準(zhǔn)備加樣溫育洗板顯色比色結(jié)果判斷結(jié)果報(bào)告及解釋第69頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五標(biāo)本的收集和保存

一般為血清標(biāo)本，此外亦有唾液、尿液等其它體液；避免嚴(yán)重溶血，否則可能會(huì)增加非特異顯色；避免細(xì)菌污染，否則會(huì)因菌體中內(nèi)源性HRP而產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)；避免反復(fù)凍融；血清如有混濁或沉淀，離心或過(guò)濾后檢上清第70頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五試劑準(zhǔn)備從冰箱中取出的試劑，待溫度與室溫平衡后使用；所用蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。第71頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五加樣避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。

第72頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五溫育

常采用的溫育溫度有43℃、37℃、室溫和4℃等。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫育溫度高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。溫育時(shí)，微孔板應(yīng)置于水?。ǜ∮谒妫┗驖窈兄?，以使反應(yīng)溶液的溫度迅速與溫室平衡。第73頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五洗板每次溫育后洗板是否徹底，與非特異背景顯色有很大關(guān)系。第74頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五顯色加入底物A和B后，應(yīng)振蕩混勻當(dāng)?shù)孜餅镺PD時(shí)，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行

第75頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五比色

加酸終止顯色反應(yīng)后，比色測(cè)定前應(yīng)振蕩混勻測(cè)定時(shí)，要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適比較好的酶標(biāo)儀可選擇單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色測(cè)定，所謂雙波長(zhǎng)比色，即在敏感波長(zhǎng)（此時(shí)對(duì)所顯色具最大光吸收）如450nm和非敏感波長(zhǎng)（所測(cè)得的光吸收為微孔板上的劃痕、污跡以及指紋等所致），最后從儀器得到的讀數(shù)為在敏感波長(zhǎng)測(cè)得的吸光度與非敏感波長(zhǎng)測(cè)得的吸光度之差。第76頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五結(jié)果判斷按照試劑盒確定的Cut-off值判斷結(jié)果

ELISA測(cè)定的“灰區(qū)”（可疑結(jié)果的含義）

第77頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五定性？定量？定性測(cè)定常以“有”或“無(wú)”也即“陽(yáng)性”或“陰性”來(lái)表達(dá)測(cè)定結(jié)果；半定量測(cè)定雖介于定性和定量之間，但從嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)，其仍屬于定性測(cè)定，只不過(guò)其對(duì)定性測(cè)定中的“陽(yáng)性”作了進(jìn)一步的分級(jí)，即所謂的強(qiáng)陽(yáng)性·陽(yáng)性·弱陽(yáng)性的區(qū)別；定量測(cè)定的結(jié)果則以濃度（如IU/L、ug/L等〕的方式表達(dá)。第78頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五定性測(cè)定結(jié)果確定的依據(jù)定性測(cè)定結(jié)果確定的依據(jù)在于陽(yáng)性陰性判定值（Cut-off）的建立，Cut-off值的確立應(yīng)盡可能地避免假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。除了Cut-off值以外，還有許多其它的設(shè)值方法以判斷陰性和陽(yáng)性結(jié)果，如S/N（常稱(chēng)為P/N）比值（Ratio）等。

第79頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五概念陽(yáng)性測(cè)定能力指數(shù)（DI（＋））可定義為一實(shí)驗(yàn)對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)定后給出陽(yáng)性結(jié)果的能力（通常稱(chēng)為“敏感性”）；DI（＋）=[真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）]×100%

陰性測(cè)定能力指數(shù)（DI（－））則為對(duì)陰性樣本測(cè)定給出陰性結(jié)果的能力（通常稱(chēng)為“特異性”）；DI（－）=

[真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）]×100%

第80頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五概念陽(yáng)性結(jié)果的可靠性（‘預(yù)示值’）即測(cè)定為陽(yáng)性的標(biāo)本實(shí)際上為陽(yáng)性的可能性。

=[真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陽(yáng)性）]×100%陰性結(jié)果的可靠性則為一份給出陰性結(jié)果的樣本實(shí)際上為陰性的可靠性。

=[真陰性/（真陰性+假陰性）]×100%第81頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五測(cè)定結(jié)果的報(bào)告和數(shù)據(jù)處理

酶免疫測(cè)定數(shù)據(jù)處理報(bào)告在理想情況下應(yīng)達(dá)到下述要求:(1)易于讓不熟悉該試驗(yàn)的人所理解;(2)定性測(cè)定必須結(jié)果明確,即陽(yáng)性或陰性、反應(yīng)或不反應(yīng)、在正常范圍內(nèi)或不正常等；（3）定量測(cè)定的線性；（4）數(shù)據(jù)的可重復(fù)性；第82頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五定義特異性Specificity真陰性結(jié)果數(shù)真陰性結(jié)果數(shù)+假陽(yáng)性結(jié)果數(shù)第83頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五定義敏感性Sensitivity真陽(yáng)性結(jié)果數(shù)真陽(yáng)性結(jié)果數(shù)+假陰性結(jié)果數(shù)第84頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五定義陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）真陽(yáng)性結(jié)果數(shù)真陽(yáng)性結(jié)果數(shù)+假陽(yáng)性結(jié)果數(shù)第85頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五定義陰性預(yù)測(cè)值（NPV）真陰性結(jié)果數(shù)真陰性結(jié)果數(shù)+假陰性結(jié)果數(shù)第86頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五1.不需r-計(jì)數(shù)器、熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測(cè)儀等貴重儀器，

更適用于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。

2.沒(méi)有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質(zhì)的參與，

更加安全。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和金標(biāo)探針可以長(zhǎng)期保存。

4.自帶質(zhì)控對(duì)照，不需其它試劑。

5.由于省去了底物反應(yīng)這一步，因此和EIA相比，時(shí)間大

大縮短，簡(jiǎn)單快速，可單人份操作。

6.由于操作簡(jiǎn)單快速，可用于個(gè)人或家庭檢測(cè)。一、快速檢測(cè)試紙條的優(yōu)勢(shì)WT第87頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五

膠體金即金的水溶液，是一種帶負(fù)電荷的疏水膠體溶液，顆粒之間由于靜電作用而保持一個(gè)穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，可通過(guò)還原劑將氯化金分子聚合成特定大小的金顆粒來(lái)制備。膠體金通過(guò)靜電及其表面的物理特性與多種生物大分子結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-金顆粒復(fù)合物，即膠體金探針。特點(diǎn)：1.標(biāo)記是物理吸附過(guò)程，對(duì)生物大分子的活性沒(méi)有影響。

2.可以根據(jù)用途的不同制備不同直徑的膠體金顆粒。

3.膠體金顆粒的大小與檢測(cè)的靈敏度和特異性相關(guān)。

4.制備過(guò)程簡(jiǎn)單，易于控制。WT二、金標(biāo)試紙條原理第88頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五采用化學(xué)還原法，其過(guò)程可以認(rèn)為是一個(gè)結(jié)晶過(guò)程，顆粒的大小取決于還原劑所致晶核的形成速度和結(jié)晶生長(zhǎng)速度。目前主要有以下幾種制備方法：1.硼氫化鈉還原法（2-5nm）

2.白磷還原法（3-12nm）

3.乙醇超聲波還原法（6-10nm）

4.抗壞血酸還原法（10-15nm）

5.檸檬酸三鈉還原法（15-150nm）WT膠體金的制備第89頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五WT膠體金標(biāo)記物的制備1.待標(biāo)記生物大分子的處理：

緩沖液成分、離子強(qiáng)度、pH值、蛋白濃度。

2.膠體金顆粒的標(biāo)記：

標(biāo)記pH值、標(biāo)記濃度、穩(wěn)定劑、稀釋液。3.標(biāo)記物的濃縮純化及儲(chǔ)存：

高速離心、凝膠過(guò)濾。第90頁(yè)，共100頁(yè)，2023年，2月20日，星期五試紙條工作原理在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線上包被有HIV特異性抗原，對(duì)照線上包被有兔抗HIV抗體，另一個(gè)HIV特異性抗原在標(biāo)記膠體金后干燥于硝酸纖維素膜下端的玻璃纖維上。當(dāng)樣品由于層析原理流動(dòng)時(shí)，首先溶解干燥的金標(biāo)sAb單抗，特異性HBsAg抗原與其反應(yīng)，在流過(guò)檢測(cè)線時(shí)再和另一個(gè)單抗結(jié)合形成免疫復(fù)合物。由于包被單抗被固定在硝酸纖維素膜上，免疫復(fù)合物就被留下，逐漸形成肉眼可見(jiàn)的紅紫色條帶，此時(shí)該樣品為陽(yáng)性。繼續(xù)流動(dòng)到對(duì)照線時(shí)，金標(biāo)sAb單抗和羊抗鼠IgG結(jié)合顯色，出現(xiàn)對(duì)照帶。當(dāng)樣品中不含HBsAg特異性抗原時(shí)，標(biāo)記膠體金的單抗流過(guò)對(duì)照線時(shí)也可和該處的羊抗鼠抗體結(jié)合也可形成紅紫色條帶，導(dǎo)致對(duì)照線顯色。WT