劃痕及Transwell實驗方法20130905

劃痕實驗：細(xì)胞接種到六孔板中，每孔接約5x105個細(xì)胞（SMMC7721，不同細(xì)胞具體接種數(shù)量掌握為24h能鋪滿板），放入37°C5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),20?24h觀察是否鋪滿板。待鋪滿后開始劃痕實驗。用滅過菌的200uL黃色槍頭在每個孔中間劃一條痕（槍頭垂直劃線，每次力度均一，劃線要直，一次性劃到底，可用板蓋當(dāng)尺子，，PBS洗2遍去除劃下的細(xì)胞，顯微鏡拍照（放大倍數(shù)為100倍，。換含不同藥物的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)（空白組用PBS代替藥物，每組設(shè)3個平行，。24h或48h后拍照（放大倍數(shù)為100倍）固定點測量劃痕距離是否改變。用Photoshop中的直方圖測量間距大小，表示不同組細(xì)胞發(fā)生遷移的距離。將對照組遷移距離大小設(shè)為100%，實驗組遷移比例為：（對照組遷移距離-實驗組遷移距離，/對照組遷移距離*100%。(o」luo。jo(o」luo。jo%)QCONpapnuap￡s=aopse」.E>2Transwell實驗：1、 收取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍,再用無血清培養(yǎng)基重懸，徹底去除血清干擾，調(diào)整細(xì)胞密度1?5x105個。2、 Transwell小室（孔徑大小有不同規(guī)格，一般腫瘤細(xì)胞選8pm；遷移實驗用普通Transwell小室，侵襲實驗用含有基質(zhì)膠的Transwell小室）里加入制備好的細(xì)胞懸液（1x105個），小室內(nèi)液體總體積為200pLo3、 24孔板中加入500吐含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。將Transwell小室放入24孔板中。特別注意：下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，因此在種板和培養(yǎng)過程中要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。4、 將帶有小室的24孔板置于37°C5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，18-48h后（時間依不同實驗不同細(xì)胞而定）取出，非貼壁細(xì)胞直接計數(shù)下層細(xì)胞數(shù)，貼壁細(xì)胞拍照計數(shù)小室底部膜上細(xì)胞（步驟如下）。5、 輕輕吸出小室內(nèi)的培養(yǎng)基，用37C預(yù)熱的PBS輕輕洗一遍，每孔加入4C預(yù)冷的4%多聚甲醛（或甲醇）固定液500uL，于室溫固定細(xì)胞20min，PBS輕輕洗3次。6、 用濕棉簽輕輕刮出小室中上層細(xì)胞，重復(fù)3次。7、 PBS輕輕洗3次，吸干殘余PBS。8、 每孔加入結(jié)晶紫染色液400?500uL（沒過小室底部）于37C中孵育30min。9、 用槍吸出結(jié)晶紫并用雙蒸水輕洗3次，室溫倒置風(fēng)干。10、 顯微鏡拍照（200倍鏡下每小室的一個橫軸或縱軸拍五張圖，計算平均細(xì)胞數(shù)）。數(shù)據(jù)分析后作圖