郴州汝城地區(qū)豬瘟病毒檢測方案設(shè)計

1前言自2018年我國發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟后，我國生豬存欄量急劇下降，導(dǎo)致市場上的豬肉流通量減少，豬肉價格不斷上漲。本人在實習(xí)期間對于非洲豬瘟有了一定了解，只要及時發(fā)現(xiàn)病毒并做出相對應(yīng)計劃，這樣就能很大程度上的減少非洲豬瘟病毒對豬場的影響。本設(shè)計主要以郴州汝城地區(qū)三星工業(yè)園的豬場為出發(fā)點，對其非洲豬瘟病毒的檢測進行方案設(shè)計。2實驗室設(shè)計配配液室提取室擴增室過道通風(fēng)口對于非洲豬瘟，實驗室常用的檢測方法是熒光定量PCR檢測法，該方法靈析3.1采樣通道、車輛、門口、人員、廚房、飼料、水源、死豬、病豬、豬群、其次，采樣時應(yīng)注意防止人為污染，采樣員需戴好PE手套，對執(zhí)行人十人物品施四中轉(zhuǎn)照1-工男能我隱源轉(zhuǎn)司指財上要隔再24小后勤主蠟端內(nèi)中轉(zhuǎn)四日勤主管墻輕熱工作臟白色模行人棲行項口齒行項日扶行人壁配*8~執(zhí)行項目執(zhí)行項日熱行項目熱開項口執(zhí)行人減纏試3.1.1前處理采樣后，對樣品進行分類、標(biāo)記、編號并記錄在表上，如果當(dāng)天樣品很多，能夠?qū)⑵鋬蓚€樣品進行合樣后再進行檢測，這里需要注意的是，允許合樣的樣品最多只能是兩個，因為合樣的樣品過多，會影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。不同的樣本有不同的前處理，如下表：樣品類型前處理方式核酸提取病料組織分樣、研磨均勻200ul懸液全血/血漿/血清抗凝/促凝、分離上清拭子浸泡、取上清200ul上清液唾液離心、除雜質(zhì)200ul上清液精液液化、凍融、離心200ul上清液病毒培養(yǎng)物、疫苗一般直接用于提取200ul懸液飼料樣本粉碎后浸泡15~30分鐘200ul上清液前處理完后，取200ul上清液/懸液與20ul裂解液依次加入核酸提取試劑盒中，我們所采用的試劑盒提取核酸的方法為磁珠法。通過磁珠法我們能夠從血液、動物組織、病原微生物等樣本中分離出DNA最后，將核酸提取試劑盒放入核酸提取儀按所設(shè)程序相對應(yīng)時間等待核酸提取完成即可。3.2配液從非洲豬瘟病毒實時熒光PCR快速檢測試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(PCRMIX),融化后8000rpm離心10s。向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15ulPCR反應(yīng)液，再向已經(jīng)加入PCR反應(yīng)液的每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(PTC)5ul,放入漩渦震蕩儀中震蕩5～10秒，再7000rpm瞬時離心5s。這里需要注意的而引起重大污染。PCR反應(yīng)管中不能有氣泡，氣泡會影響實驗結(jié)果。3.3擴增及結(jié)果分析將已經(jīng)加入反應(yīng)液和樣品的pcr反應(yīng)管放入熒光定量pcr檢測儀。常陰性樣品放大曲線的最高點。在實驗成立的情況下，CT值小于等于35的樣本為陽性，它的擴增曲線也表現(xiàn)出明顯擴增趨勢，表明該核酸陽性；CT值大于40或顯示為無的樣品為陰性，表明核酸陰性；若CT值在35~40之間，則判為可疑樣品。此類樣品需要重新抽提核(如圖所示，精液包裝盒樣品末尾出現(xiàn)了明顯的擴增曲線，且CT為35.01,在可疑范圍，說明該樣品需要復(fù)檢。而復(fù)檢后仍出現(xiàn)了明顯擴增曲線，證明該樣品可判斷為陽性。)興興(1)用酒精擦拭移液器(2)用84消毒液將實驗臺面擦拭干凈(3)用核酸清除劑對瞬時離心機和核酸提取儀進行擦拭(4)清理垃圾，紫外燈開半小時(5)離心管板和鑷子用84消毒液浸泡半小時，后用清水清洗干凈、晾干場所(污染嚴重的地方),也有可能將病毒攜帶回來。(1)應(yīng)該嚴格控制人員、車輛進出，進出的人員、物品、車輛均要(2)所有人員不管進出還是休假在進入豬場前都需要隔離。(3)若發(fā)現(xiàn)死豬或病豬需及時送檢并采取措施。(4)不從外面購買豬肉制品以