肺結核實驗室診斷(馬小玲)

結核分枝桿菌的試驗室診斷安徽省立醫(yī)院檢驗科馬筱玲1現在是1頁\一共有63頁\編輯于星期四結核疫情及診斷進展

2現在是2頁\一共有63頁\編輯于星期四黛玉臉色蒼白，瘦骨嶙峋，經不斷

咳嗽及吐血后，香消玉殞，結束了一場哀怨凄絕的愛情故事。3現在是3頁\一共有63頁\編輯于星期四我國結核病疫情

全球結核病第二高負擔國家，結核病疫情表現有“六多”。一、感染人數多——5.5億人感染過結核菌，約占全國人口的45％，高于全球平均水平。二、患病人數多——活動性肺結核、傳染性肺結核患病率分別為367/10萬和122/10萬，三、新發(fā)患者多——全國每年新發(fā)活動性肺結核患者145萬，其中傳染性肺結核患者65萬。

四、死亡人數多——全國每年約有13萬人死于結核病。五、農村患者多——全國約有80％的結核病人集中在農村，主要在經濟不發(fā)達的中西部地區(qū)。六、耐藥患者多——全國結核病耐藥率高達28％。4現在是4頁\一共有63頁\編輯于星期四

結核病實驗室

診斷方法介紹5現在是5頁\一共有63頁\編輯于星期四概述結核病人的細菌學檢查不僅是發(fā)現傳染源的主要途徑和手段，也是結核病確診和制訂抗癆方案，考核療效、評價治療效果的可靠標準。由于結核菌的遺傳特性決定其生長周期長，致使常規(guī)細菌學檢查方法存在著靈敏度低、操作復雜，需時間較長和影響因素較多，不易標準化等缺陷，使細菌學診斷發(fā)展緩慢，無法充分滿足臨床診斷的需要。6現在是6頁\一共有63頁\編輯于星期四實驗室診斷方法病原學診斷輔助診斷

7現在是7頁\一共有63頁\編輯于星期四病原學診斷一、涂片抗酸染色鏡檢法，二、液基夾層杯結核桿菌檢驗三、熒光染色法四、培養(yǎng)法五、液體培養(yǎng)＋顯微鏡觀察藥敏試驗六、快速培養(yǎng)檢測法，七、色譜法八、分子生物學法

九、噬菌體生物擴增法8現在是8頁\一共有63頁\編輯于星期四一、涂片抗酸染色鏡檢法：

國內大多采用厚涂片，比薄涂片法可提高陽性率；涂片萎尼抗酸染色法能保存較久，可備復查；因費時、繁瑣，綜合醫(yī)療單位常因重視不夠，致涂陽檢出率低于5%，專業(yè)機構涂陽率可達到30%。國外痰涂片陽性率可達30%～40%，反復多次查，可增加到65%～75%；9現在是9頁\一共有63頁\編輯于星期四涂片優(yōu)點：簡便、快速、價廉

10現在是10頁\一共有63頁\編輯于星期四涂片的缺點敏感性低：5000～10000條菌／ml特異性差：所有分枝桿菌均可著色無法區(qū)別死菌與活菌：結果均為陽性11現在是11頁\一共有63頁\編輯于星期四痰菌假陰性原因病變是封閉或開放；病變性質和其中能夠排出的菌量和排出時間間歇；結核分枝桿菌形態(tài)多樣性；12現在是12頁\一共有63頁\編輯于星期四二、液基夾層杯結核桿菌檢驗工作原理將經過消化滅活處理液處理的痰液、或其他體液標本混懸液置于具有符合光學要求基片的夾層杯中，經過專業(yè)離心機離心將混懸液中細菌或細胞牢固附著基片上，并在夾層杯中直接染色后取出基片在載波片上封片，置顯微鏡下觀察。13現在是13頁\一共有63頁\編輯于星期四優(yōu)點：1、操作方便，易于掌握。2、片中結核菌分布均勻，染色效果清晰3、液基結核菌制片技術較離心濃縮集菌法有顯著提高：該方法將所有消化后標本的抗酸桿菌均完整地保留于液基薄片中，從而顯著提高了檢出率。4、安全性有所提高：消化，制片，烤片，染色均在彭氏杯中完成，操作人員不直接接觸標本。采用結核專用消化液，可有效殺滅結核分支桿菌，更好的提高了操作的安全性。14現在是14頁\一共有63頁\編輯于星期四三、熒光染色法：是涂片法中陽性率較高，較快速的方法，集菌與熒光染色相結合，則熒光顯微鏡下的抗酸桿菌陽性率可達50%，熒光法的缺點：假陽性率較高，保存時間短，不到4個月15現在是15頁\一共有63頁\編輯于星期四四、培養(yǎng)法一般都用改良羅氏固體培養(yǎng)基接種后第3第7天觀察，以后每周觀察一次菌落生長情況，第8周若仍無生長，報告為陰性。優(yōu)點：準確，靈敏度略高于涂片法；可以鑒定死菌與活菌；可進一步進行菌種鑒定和藥敏試驗.缺點：診斷周期長，最快也需要6周。有一定的污染率16現在是16頁\一共有63頁\編輯于星期四17現在是17頁\一共有63頁\編輯于星期四培養(yǎng)假陰性的原因個別細菌營養(yǎng)要求的特異性；細菌和細菌營養(yǎng)代謝異質性；細菌培養(yǎng)前處理對細菌活性影響；18現在是18頁\一共有63頁\編輯于星期四分枝桿菌藥物敏感性試驗絕對濃度法檢測分枝桿菌藥敏實驗是采用含藥羅氏培養(yǎng)基進行的。常用藥物終濃度（μg/ml）____表1絕對濃度法含藥培養(yǎng)基中的藥物終濃度_____

藥物濃度（μg/ml）低濃度高濃度異煙肼1μg/ml10μg/ml利福平1μg/ml10μg/ml鏈霉素10μg/ml100μg/ml乙胺丁醇5μg/ml50μg/ml對氨基水楊酸1μg/ml10μg/ml氨硫脲10μg/ml100μg/ml乙硫異煙胺25μg/ml100μg/ml卡那霉素10μg/ml100μg/ml卷曲霉素10μg/ml100μg/ml紫霉素10μg/ml100μg/ml氧氟沙星5μg/ml50μg/ml左氧氟沙星5μg/ml50μg/ml環(huán)丙沙星5μg/ml50μg/ml司帕沙星5μg/ml50μg/ml力克肺疾1μg/ml10μg/ml丁胺卡那10μg/ml100μg/ml

19現在是19頁\一共有63頁\編輯于星期四檢測方法1．菌懸液的制備2.接種及培養(yǎng)3.結果判定與報告敏感（一）：含藥培養(yǎng)基上無菌落生長。報告菌落數：當含藥培養(yǎng)基上菌落數在20個以下時，報告菌落個數。耐藥（1+）：含藥培養(yǎng)基上菌落數約占斜面面積1/4；耐藥（2+）：含藥培養(yǎng)基上菌落數約占斜面面積1/2；耐藥（3+）：含藥培養(yǎng)基上菌落數約占斜面面積3/4；耐藥(4+)：含藥培養(yǎng)基上菌落呈菌苔樣生長。20現在是20頁\一共有63頁\編輯于星期四

本法弊端

操作繁瑣需時久，4周結果準確性差21現在是21頁\一共有63頁\編輯于星期四五、液體培養(yǎng)＋

顯微鏡觀察藥敏試驗

是2000年建立的一種痰標本液體培養(yǎng)結合顯微鏡觀察技術。其原理是MTB含有索狀因子，因此其在液體培養(yǎng)基中生長時分泌索狀因子，形成索狀特征性結構，利用倒置顯微鏡觀察索狀結構可用于MTB的快速診斷。由于液體培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，因此MTB生長迅速，使MTB的培養(yǎng)時間顯著縮短，培養(yǎng)陽性率顯著增加。該法還能在培養(yǎng)的同時直接進行臨床標本的直接藥敏試驗，因此能顯著縮短從臨床標本到耐藥性測定的所需時間，這是其它傳統(tǒng)方法所不具有的，也是MODS的最大優(yōu)點。22現在是22頁\一共有63頁\編輯于星期四

液體培養(yǎng)

+

顯微鏡觀察23現在是23頁\一共有63頁\編輯于星期四結論本試劑檢測簡便，快速，3天就可獲得多耐藥結核桿菌的檢測結果，同時具有較高的敏感性和特異性，與常規(guī)方法符合率較高，可用于多耐藥結核病的快速檢測。痰標本直接藥敏試驗比常規(guī)方法提早6～8周，更具有快速診斷價值。本試劑費用低廉，不需特殊儀器設備，適合基層推廣應用。本法安全、對預防耐藥結核病的流行與傳播、防止實驗室工作人員的感染具有重要意義。24現在是24頁\一共有63頁\編輯于星期四六、快速培養(yǎng)檢測法1.BDBACTECMGIT960培養(yǎng)系統(tǒng)2.BacTALERT3D培養(yǎng)系統(tǒng)25現在是25頁\一共有63頁\編輯于星期四1.BDBACTECMGIT960培養(yǎng)系統(tǒng)

基本原理

培養(yǎng)瓶底部含有包被于樹脂上的熒光顯示劑，由于該顯示劑為氧抑制性，當分支桿菌生長使氧消耗后，熒光顯示劑被激活，而發(fā)出熒光。檢測儀測試熒光強度，并判定結果。優(yōu)點：快速7-14天培養(yǎng)陽性

簡便比常規(guī)法操作簡便，培養(yǎng)陽性率高于L-J法缺點：無法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于L-J法，產品依賴進口，價格較貴26現在是26頁\一共有63頁\編輯于星期四2．BacTALERT3D培養(yǎng)系統(tǒng)原理：該系統(tǒng)采用產色檢測技術檢測培養(yǎng)系統(tǒng)中分支桿菌生長情況。因其所用的培養(yǎng)瓶底部有顏色感應器，當培養(yǎng)瓶中有細菌生長，C02產生、pH下降時，顏色感應器由綠色變成黃色。儀器自動連續(xù)檢測，檢測的數據輸入計算機，根據計算結果自動顯示培養(yǎng)瓶中有無分支桿菌生長。優(yōu)點：快速7-14天培養(yǎng)陽性

簡便比常規(guī)法操作簡便，培養(yǎng)陽性率高于L-J法缺點：無法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于L-J法，產品依賴進口，價格較貴。27現在是27頁\一共有63頁\編輯于星期四七、色譜法

分為氣相色譜(GC)、氣液相色譜、高效液相色譜(HPLC)等GC等能檢測分枝桿菌代謝過程中的揮發(fā)性物質如脂肪酸所產生的CO2含量，出現不同的色譜峰，從而可鑒定結核桿菌和大部分NTM菌種，且可測藥敏。優(yōu)點：簡單、快速、定量、重復性好，GC與質譜(MS)聯用更好；缺點：儀器昂貴，維護不易，無法普及。

28現在是28頁\一共有63頁\編輯于星期四八、分子生物學法

利用分子生物學檢測方法來檢測結核桿菌特異性基因片斷，從而為結核病的快速診斷提供依據。1、聚合酶鏈反應(PCR)：2、核酸探針(DNA-probe)3、染色體核酸指紋法：4、16s～23srDNA(rRNA)序列法5、耐藥基因的檢則：6、其它分子生物學方法29現在是29頁\一共有63頁\編輯于星期四1、聚合酶鏈反應(PCR)：PCR能快速擴增結核分枝桿菌DNA，PCR檢測假陽性和假陰性問題是影響其應用的關鍵問題。對于存在的問題對策如下：擴增產物特異性鑒定－探針雜交高質量試劑（建立國家級檢定考評）規(guī)范化操作（培訓操作人員）質量控制（標準實驗室）30現在是30頁\一共有63頁\編輯于星期四2、核酸探針(DNA-probe)DNA探針是一小段帶標記而能識別特異性核苷酸序列的單鏈分子。3、染色體核酸指紋法：有多種方法，如限制性內切酶圖譜(REA)和限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)分析等，RFLP用于菌株菌種鑒定和流行病學調查研究。31現在是31頁\一共有63頁\編輯于星期四4、16s～23srDNA(rRNA)序列法用于分枝桿菌的菌種鑒定，差不多所有種的分枝桿菌都可鑒定出來。5、耐藥基因的檢則：已查出的結核桿菌耐藥基因有rpoB(對利福平)，Kat、inhA、ahpC(對異煙肼)，embl(對乙胺丁醇)，rpsL、rrs(對鏈霉素)，pncA(對吡嗪酰胺)和gyrA(對氟喹諾酮類，gyrB則為低度耐藥)等。32現在是32頁\一共有63頁\編輯于星期四九、噬菌體生物擴增法（PhaB）該法1997建立，并用于結核分枝桿菌耐藥性測定。近年來進展很快。33現在是33頁\一共有63頁\編輯于星期四檢測原理

分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌，并在菌體內增殖，裂解菌體，釋放出的子代噬菌體，即可感染隨后加入的指示細胞（也是一種分枝桿菌），并使指示細胞裂解，在培養(yǎng)皿上出現噬菌斑。若先將待檢菌株與某種藥物作用一段時間后在加噬菌體檢測，并以不加藥管為對照，根據含藥管和不含藥管出現的噬菌斑情況即可判斷細菌的耐藥性。34現在是34頁\一共有63頁\編輯于星期四噬菌體

－病毒核酸衣殼只能在活的易感細胞內生長溶原性感染和溶菌性感染35現在是35頁\一共有63頁\編輯于星期四M.tuberculosiscell特異性噬菌體識別MTB,并與之結合36現在是36頁\一共有63頁\編輯于星期四噬菌體DNA進入MTB細胞,并在其內擴增;同時生產蛋白外殼,開始產生新的病毒顆粒DNA37現在是37頁\一共有63頁\編輯于星期四添加特異性殺病毒劑去除所有MTB胞外的噬菌體,胞內噬菌體不受損傷。38現在是38頁\一共有63頁\編輯于星期四終止殺病毒反應，添加非致病性，快生長分枝桿菌（敏感細胞）39現在是39頁\一共有63頁\編輯于星期四結核分枝桿菌破裂，釋放噬菌體。40現在是40頁\一共有63頁\編輯于星期四MTB細胞周圍的敏感細胞，并在其胞內增殖41現在是41頁\一共有63頁\編輯于星期四經過多個“感染—增殖—細胞消融”循環(huán)，在瓊脂培養(yǎng)基中的菌苔上形成肉眼可見，清晰的噬菌斑42現在是42頁\一共有63頁\編輯于星期四43現在是43頁\一共有63頁\編輯于星期四結核分枝桿菌殺病毒劑殺滅未感染MTB的噬菌體敏感細胞敏感細胞敏感細胞敏感細胞MTB裂解,釋放出來的噬菌體感染敏感細胞噬菌體感染結核分枝桿菌產生噬菌斑先以特異性噬菌體感染、裂解標本中的結核分枝桿菌，再用殺病毒劑清除所有未感染MTB的噬菌體，而結核分枝桿菌胞內的噬菌體繼續(xù)擴增，進而裂解細胞，釋放噬菌體。裂解釋放的噬菌體感染隨即添加的敏感細胞，在其胞內擴增并裂解敏感細胞，敏感細胞菌苔上肉眼可見的噬菌斑。如待檢標本不含結核分枝桿菌，噬菌體被殺病毒劑完全清除，故無噬菌體感染敏感細胞，敏感細胞菌苔上無噬菌斑出現。44現在是44頁\一共有63頁\編輯于星期四質控

陽性對照≥20個噬菌斑

陰性對照≤10個噬菌斑結果判斷標準標本

陽性結果≥20個噬菌斑

陰性結果≤19個噬菌斑陰性：無噬菌斑陽性：可數噬菌斑陽性：噬菌斑部分融合陽性：噬菌斑完全融合45現在是45頁\一共有63頁\編輯于星期四適用范圍可檢測痰液、胸水、腹水、腦脊液、尿、骨髓等多種標本用于結核病的實驗診斷抗癆治療效果的評價※尤其是初診病人的鑒別診斷※用于結核菌耐藥性的快速檢測用于HIV高危人群的鑒別診斷

FromEngland!46現在是46頁\一共有63頁\編輯于星期四藥敏試驗47現在是47頁\一共有63頁\編輯于星期四

M.tbbacillusSensorcellSensorcellSensorcellSensorcellSensorcell指示細胞指示細胞指示細胞指示細胞指示細胞l

室溫5分鐘37℃1小時18-24小時加入殺毒劑加入培養(yǎng)基和指示細胞藥物＋細菌↓24-48小時加入噬菌體MTBMTB48現在是48頁\一共有63頁\編輯于星期四RFP敏感株結果

無RIF含RIF49現在是49頁\一共有63頁\編輯于星期四RFP耐藥株結果

無RIF含RIF50現在是50頁\一共有63頁\編輯于星期四上海市結核（肺）重點實驗室

方法評價－優(yōu)點快速：24～48小時比較靈敏：200～300條/ml檢測活菌：相對定量：安全：51現在是51頁\一共有63頁\編輯于星期四上海市結核（肺）重點實驗室方法評價－缺點操作步驟多影響因素多有假陽性和假陰性

假陰性率10～88％假陽性率2～48％52現在是52頁\一共有63頁\編輯于星期四上海市結核（肺）重點實驗室假陽性和假陰性原因噬菌體的交叉感染－6種NTM檢測結果陽性

（偶然、胞內、金色、丁酸、恥垢、草分枝）操作因素對結果的影響

53現在是53頁\一共有63頁\編輯于星期四輔助診斷一、免疫學診斷方法二、血清學診斷三、酶學診斷54現在是54頁\一共有63頁\編輯于星期四一、免疫學診斷方法PPD皮試，用于鑒別診斷有參考意義。T細胞亞群和一些細胞因子：CD3、CD4/CD8、IL-2(R)、干擾素、腫瘤壞死因子等檢查，以了解細胞免疫狀態(tài)，或作為考核指標前后對比。55現在是55頁\一共有63頁\編輯于星期四二.血清學診斷－結核抗體檢測(1)結明試驗(MycoDot)，分枝桿菌細胞壁富含脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，為一種抗原，能誘發(fā)宿主產生相應抗體，激發(fā)遲發(fā)超敏反應，不提供