分子克隆試驗報告

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試驗名稱：分子克隆、分子雜交、基因表達檢測試驗類型：綜合性指導(dǎo)教師：李一博班級：A姓名：孫陽陽學號：2023304110100試驗時間：2023/8/19—2023/8/25

試驗一分子克隆

DNA重組技術(shù)包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內(nèi)容。DNA片段的克隆技術(shù)是分子操作的核心部分

試驗原理及方法

DNA提取：（CTAB法）CTAB是一種非離子去污劑，植物材料在CTAB的處理下，結(jié)合65?C水浴使細胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA被釋放出來。CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再用70－75%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。再經(jīng)過氯仿/異戊醇(24:1)抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來純化DNA，最終經(jīng)異丙醇或乙醇等DNA沉淀劑將DNA沉淀分開出來。感受態(tài)細胞的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

質(zhì)粒提?。涸趐H12.0~12.6堿性環(huán)境中，細菌大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA依舊為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質(zhì)粒DNA

CaCl2法：利用冰冷的CaCl2處理對數(shù)生長期的細胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)〞，易于攝取外源DNA。106～107轉(zhuǎn)化子/?gDNA。

酶切酶連：限制性內(nèi)切酶可識別特定位點并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平末端的外源片段，經(jīng)純化處理后的DNA用于連接反應(yīng)；選擇克隆載體pUC19多克隆位點上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現(xiàn)外源片段的克隆。

試驗材料和試劑

攜帶pUC19質(zhì)粒載體的大腸桿菌菌液；

攜帶含有水稻DNA片段的M812載體的大腸桿菌菌液；氨芐青霉素、卡那霉素；RNaseA；堿裂解法試劑

SolutionI:Tris.HCl（pH7.5）50mM

EDTA10mMRNaseA

100μg/ml

SolutionII:NaOH0.2MSDS

1%

SolutionIII:KAC1.32M

UsingHACtoadjustpHto4.8

TE(pH8.0)：Tris.HCl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）1mM苯酚/氯仿、無水乙醇或異丙醇

主要試驗步驟

1.兩種載體的抽提

2.瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA的質(zhì)量3.兩種載體的限制性內(nèi)切酶消化

4.目的片段的回收及亞克隆載體的去磷酸化5.載體與外源DNA的連接6.感受態(tài)細胞的制備7.連接子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞8.重組子篩選及鑒定

試驗結(jié)果與分析

1.質(zhì)粒的質(zhì)量檢測，-20℃保存。菌種個人編號濃度ng/ulA260/2801.881.861.811.891.861.831.861.80電泳結(jié)果，只檢測條帶不有點markerM5、M6條帶較亮有拖帶，可能點樣偏多A260/280質(zhì)較好，提取效果比較好

M5P5M6P6

PUC19567856M81278248.5325.6244.6297.6609.6603.3592.2689.72.瓊脂糖凝膠電泳點樣順序pUC19質(zhì)粒酶切產(chǎn)物(1—4)pUC19質(zhì)粒對照（5）Marker（6）M812質(zhì)粒對照（7）

M812質(zhì)粒酶切產(chǎn)物（8—11）3.涂皿生長結(jié)果

5,6,7,8藍白斑不明顯，肉眼可見藍色小斑點。陽性對照藍色斑點好多也長了白斑。

產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能無菌操作有問題，感受態(tài)制備不好。

1234567891011

PUC19PUC19酶切后

試驗二、分子雜交

對于大的基因組，DNA酶切圖譜憑肉眼是分辯不開的（EB染色），由于大小不等的分子浮現(xiàn)彌散分布，只有借助靈敏的放射性同位素（或其他發(fā)光物質(zhì)），將靶DNA在凝膠上（膜上）的帶型通過特定的探針與之雜交，轉(zhuǎn)換成X光片上直觀的帶型，才能進行相關(guān)分析。另外假使需要鑒定或?qū)ひ捙c已知DNA同源的DNA片段如：染色體步查、基因組文庫的評價和利用、陽性克隆的分析鑒定、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)分析等也都需進行DNA的分子雜交試驗。雜交探針的標記可以采用同位素或地高辛標記，兩種標記探針的分子雜交、洗膜過程和信號檢測方法不同。

試驗?zāi)康模核巨D(zhuǎn)基因植株的陽性鑒定及拷貝數(shù)檢測

試驗原理：

帶正電荷的尼龍膜強度高，不易破損，具有較大的DNA結(jié)合容量，它能夠吸附變性DNA，核酸以共價結(jié)合方式不可逆的結(jié)合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有同樣吸附DNA功能，經(jīng)向上的毛細吸附作用，在轉(zhuǎn)移緩沖液的帶動下把DNA從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。DNA轉(zhuǎn)到膜上是復(fù)制膠上的帶型，在80-100℃真空枯燥2-4hrs，即可固定DNA。轉(zhuǎn)膜方法一般有兩種，即鹽轉(zhuǎn)移和堿轉(zhuǎn)移，本試驗選用鹽轉(zhuǎn)移的方法。

試驗過程

1.植物總DNA的抽提2.植物總DNA質(zhì)量檢測3.DNA的瓊脂糖凝膠電泳4.限制性內(nèi)切酶操作5.SouthernBlotting

6.探針的地高辛標記、雜交、免疫反應(yīng)及顯色

試驗結(jié)果與分析

植物總DNA濃度檢測結(jié)果編號A260/28052.01613742.1372.1482.18濃度ng/ul1979.8968.11436.8A5A6A7A8

A260/A280值偏高，可能提取過程中RNA未除盡。DNA酶切酶切效果檢測

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)見DNA酶切圖，照膠不太明了，A5-A8酶切條帶有，能

分子雜交結(jié)果照像

只有marker和陽性對照結(jié)果出現(xiàn)其他均無雜交條帶，可能DNA酶切質(zhì)量不好，或者電泳膠上邊切多了，Marker+—5678

夠看到切開，剩余產(chǎn)物可電泳做分子雜交

雜交條帶在上

面未轉(zhuǎn)到膜上。

雜交顯影

試驗三、基因表達檢測

在轉(zhuǎn)錄水平上研究和了解基因的表達與調(diào)控是分子生物學和基因操作的重要內(nèi)容。Northern雜交可以測定總RNA或poly(A)+RNA中特定mRNA分子的大小和表達豐度，RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中電泳，按其分子的大小分開，然后將RNA轉(zhuǎn)至尼龍膜或硝酸纖維素膜上，經(jīng)過體外鉸鏈固定，用放射性同位素標記的DNA或RNA探針與之雜交，放射自顯影后即可以得到待測基因RNA表達水平的狀況；RT-PCR以mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA作為PCR的模板進行擴增，比Northern雜交更靈敏，對RNA的質(zhì)量要求較低，操作簡便，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因時空表達的常用方法。

試驗原理：

mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可作為PCR的模板進行擴增稱為RT-PCR；RT-PCR比Northern雜交更靈敏，對RNA的質(zhì)量要求較低，操作簡便，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因時空表達的常用方法。

試驗?zāi)康模簷z測基因的表達水平試驗過程

1.植物總RNA的抽提（trizol）2.RNA電泳3.mRNA的反轉(zhuǎn)錄4.PCR技術(shù)5.RT-PCR

試