鏈球菌、腸球菌課件

實(shí)驗(yàn)五

鏈球菌及腸球菌的鑒定

目的要求：1.掌握鏈球菌屬及腸球菌屬的分離培養(yǎng)與鑒定方法。2.掌握鏈球菌及鏈球菌的菌落特點(diǎn)、菌體形態(tài)及染色性。步驟與方法1、觀察菌落將菌株接種于血瓊脂平板上，35℃孵育18-24h后觀察菌落，記錄菌落大小、形態(tài)、表面、邊緣、透明及顏色、有無溶血及特點(diǎn)。將肺炎鏈球菌繼續(xù)孵育2-3天看菌落中心有無凹陷呈“臍狀”。β溶血性鏈球菌2、形態(tài)觀察涂片、革蘭氏染色鏡檢，記錄鏡下細(xì)菌染色性、大小、形態(tài)、排列及莢膜。

肺炎鏈球菌S.pneumoniae形態(tài)與染色：G+球菌,矛頭狀,成雙排列，寬端相對，尖端向外,有莢膜肺炎鏈球菌莢膜染色特點(diǎn)肺炎鏈球菌S.pneumoniae

培養(yǎng)特性：營養(yǎng)要求高，兼性厭氧。初次分離需提供5%-10%的CO2。18-24h后血平板上形成灰白色、圓形、針尖樣的菌落。菌落周圍有草綠色溶血環(huán)。肺炎鏈球菌S.pneumoniae培養(yǎng)特性：培養(yǎng)48h后，菌落有自溶現(xiàn)象，菌落的中心會出現(xiàn)凹陷，像“肚臍”稱臍狀凹陷。膽汁溶菌試驗(yàn)原理：膽汁或膽鹽能活化肺炎鏈球菌的自溶酶，促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞膜破損或菌體裂解而自溶。方法：A、平板法：在血瓊脂平板上選擇出待檢的草綠色溶血的菌落，觀察記錄菌落特點(diǎn)，然后于菌落上加一滴去氧膽酸鈉溶液，35℃孵育15-30min觀察結(jié)果。B、試管法：將甲型鏈球菌和肺炎鏈球菌血清肉湯培養(yǎng)液1ml分別加入2支試管，再于各管中加入去氧膽酸鈉溶液0.1ml，搖勻后置于37℃水浴30min后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：平板法若菌落消失為陽性，不消失為陰性，試管法若液體由渾濁變透明為陽性，不透明為陰性，此試驗(yàn)是鑒別甲型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌的重要試驗(yàn)，后者陽性。痰標(biāo)本肺炎鏈球菌革蘭染色化膿性鏈球菌A群(化膿性)鏈球菌

生物學(xué)性狀

營養(yǎng)要求高：血平板或含血清培養(yǎng)基；

液體培養(yǎng)為沉淀生長；

血平板呈灰白色表面光滑小菌落，不同

菌株溶血不一，

多數(shù)有透明溶血環(huán)(b溶血現(xiàn)象)。2.培養(yǎng)特性桿菌肽敏感試驗(yàn)原理：A群化膿性鏈球菌對桿菌肽幾乎100%敏感，而其他鏈球菌對桿菌肽通常耐藥。方法：挑取被檢菌落，密涂于血瓊脂平板上，將桿菌肽紙片（0.04U/片）貼于平板上，35℃孵育18-24h觀察。結(jié)果判斷：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，推斷為A群化膿性鏈球菌。B群無乳鏈球菌CAMP試驗(yàn)原理：B群溶血性鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，該物質(zhì)可促進(jìn)金黃色葡萄球菌β溶血素的活性，故在血瓊脂平板上兩菌交界處溶血能力增強(qiáng)，形成箭頭狀透明溶血區(qū)。方法：在羊血瓊脂平板上，用金黃色葡萄球菌劃種一條橫線，在將被檢菌距金葡菌接種線3mm處直角接種一短線，35℃培養(yǎng)18-24h觀察結(jié)果。同時設(shè)陽性對照和陰性對照。

結(jié)果報告：在兩種細(xì)菌劃線的交接處出現(xiàn)箭頭型透明溶血區(qū)為陽性，否則為陰性，此試驗(yàn)為B群鏈球菌與其他鏈球菌鑒別的重要試驗(yàn)，無乳鏈球菌為陽性，其他為陰性。CAMP陽性馬尿酸水解試驗(yàn)原理：B群鏈球菌有馬尿酸水解酶，可水解馬尿酸為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸可與FeCl3，結(jié)合形成苯甲酸鐵沉淀。方法：取待檢菌純培養(yǎng)物接種于馬尿酸鈉培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)48h，3000r/min離心30min,吸取上清液0.8ml于另一試管，加入FeCl30.2ml，立即混勻，10-15min觀察結(jié)果。

結(jié)果：出現(xiàn)恒定沉淀物為陽性。

方法：挑取菌落2-3個轉(zhuǎn)種于含有提取酶的試管中，使其成為乳化均勻的菌懸液，置37℃水浴15min。在卡片的相應(yīng)區(qū)域滴加一滴A、B、C、D、F、G致敏膠乳，再加入處理后的菌懸液一滴分別與膠乳混勻，同時在卡片相應(yīng)區(qū)域加一滴控制液與任意一滴致敏乳膠混勻，作為陽性對照，輕搖卡片，觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：在2-10min內(nèi)發(fā)生膠乳凝集，為陽性。待檢菌與哪群致敏膠乳凝集就表明該菌為相應(yīng)血清群的鏈球菌。Lancefield血清凝集分型（7）膠乳凝集試驗(yàn)：原理：抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）高滴度的病人血清被適量的溶血素“O”中和后，失去了正常水平量的抗體，多余抗“O”抗體與ASO膠乳試劑反應(yīng)，出現(xiàn)清晰、均勻的凝集顆粒。

方法：先將病人血清56℃30min滅活，然后用生理鹽水做1：15稀釋。在反應(yīng)板個空內(nèi)分別滴加稀釋血清、陽性和陰性對照血清1滴（50ul），再于各孔內(nèi)滴加1滴溶血素“O”溶液，輕搖1min混勻，最后在各孔內(nèi)分別滴加1滴ASO膠乳試劑，輕搖3min后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：出現(xiàn)凝集為陽性、不凝集為陰性。ASO陽性可認(rèn)為患者近期受溶血性鏈球菌感染過，可輔助診斷風(fēng)濕熱、腎小球腎炎等疾病。腸球菌屬步驟和方法1、菌落觀察:

將菌株接種于血瓊脂平板上，35℃孵育18-24h后觀察菌落，腸球菌在血瓊脂平板上呈灰白色、不透明、表面光滑的小菌落，菌落周圍可出現(xiàn)α溶血環(huán)，也可無溶血環(huán)。

2、形態(tài)觀察涂片、革蘭氏染色鏡檢，記錄鏡下細(xì)菌染色性、大小、形態(tài)及排列。腸球菌形態(tài)類似鏈球菌，為單個、成雙或短鏈狀排列的卵圓形革蘭氏陽性球菌。3、生化反應(yīng)：（1）觸酶試驗(yàn)：腸球菌屬為陰性反應(yīng)。（2）膽汁-七葉苷試驗(yàn)：原理：培養(yǎng)基的膽汁對某些細(xì)菌有抑制作用，只有既能在膽汁中生長，又能水解七葉苷的細(xì)菌才能表現(xiàn)出對七葉苷的水解活性。腸球菌能在膽汁中生長，并水解七葉苷，使培養(yǎng)基變黑。

方法：將被檢菌1~3個菌落接種于膽汁-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基，35℃孵育18~24h。結(jié)果：細(xì)菌生長，且培養(yǎng)基變黑色或棕褐色為陽性，不變色為陰性。腸球菌為陽性。（3）65g/LNaCl生長試驗(yàn)：原理：腸球菌有很強(qiáng)的耐鹽能力，能在65g/LNaCl血清肉湯培養(yǎng)基中生長，而鏈球菌的耐鹽能力較弱，在此培養(yǎng)基中不能生長。方法：將待檢菌接種65g/LNaCl血清肉湯中，35℃孵育18-24h。結(jié)果：細(xì)菌生長且使得培養(yǎng)基變黃為陽性，不生長為陰性，腸球菌為陽性。（3）PYR試驗(yàn)：原理：多數(shù)腸球菌含有吡咯烷酮芳基酰胺酶，能水解吡咯烷酮-β-萘基酰胺（PYR），釋放出β-萘基酰胺，與PYR試劑作用形成紅色復(fù)合物。