花生及制品中過(guò)敏原成份的測(cè)定酶聯(lián)免疫法編制說(shuō)明

《花生及制品中過(guò)敏原成份的測(cè)定

酶聯(lián)免疫法》標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明任務(wù)來(lái)源和工作情況按照國(guó)標(biāo)委綜合[2007]114號(hào)文件要求，天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室（天津市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督查驗(yàn)測(cè)試中心）承擔(dān)了《花生及其花生制品中過(guò)敏原成份的測(cè)定酶聯(lián)免疫法》（任務(wù)編號(hào)-T-449）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制定工作。編制組通過(guò)普遍搜集資料、認(rèn)真總結(jié)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，組織國(guó)內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，參考國(guó)內(nèi)和國(guó)際相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，特別是與必發(fā)分析系統(tǒng)銷售（北京）有限公司協(xié)作，按照項(xiàng)目?jī)?nèi)容肯定了該項(xiàng)工作的具體方案和工作計(jì)劃，依照項(xiàng)目要求開展工作。。本標(biāo)準(zhǔn)是依照GB/T《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部份：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》的要求進(jìn)行編寫的。編制本標(biāo)準(zhǔn)的目的和意義花生營(yíng)養(yǎng)豐碩，常被用作食物或飼料的原料。但是，花生卻是最強(qiáng)過(guò)敏，性物質(zhì)。其果粒中高達(dá)25%的蛋白質(zhì)成份在具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)也具有過(guò)敏性。其總蛋白含量的百分之十由過(guò)敏性蛋白（如花生球蛋白、伴花生球蛋白）組成。強(qiáng)過(guò)敏性人員僅攝入毫克級(jí)別的花生即可引致過(guò)敏反映，癥狀輕則僅為過(guò)敏性皮炎，重則因過(guò)敏性休克致使死亡。因?yàn)榛ㄉ^(guò)敏是終身性存在的且無(wú)法根治，所以對(duì)此類過(guò)敏人員而言，最重要的即是避免攝入花生。但是食物、化妝品或飲料中的花生成份或污染往往很難被檢測(cè)出來(lái)?；ㄉ潜籉AO/WHO所認(rèn)定的人類食物中的八大主要過(guò)敏原之一，普遍存在于各類食物中，食物過(guò)敏人群中有30%的人對(duì)花生過(guò)敏，花生蛋白是食物過(guò)敏致使死亡的主要過(guò)敏原。同時(shí)，花生過(guò)敏的最低致敏劑量極低—1mg）。因此，花生過(guò)敏原的檢測(cè)是食物工業(yè)的當(dāng)務(wù)之急?；ㄉ^(guò)敏問題作為食物安全問題愈來(lái)愈引發(fā)人們的關(guān)注。為此各國(guó)特別是西方發(fā)達(dá)國(guó)家制定了各類法令或條款對(duì)食物過(guò)敏原和食物標(biāo)簽作出規(guī)定。美國(guó)國(guó)會(huì)兩院最近通過(guò)了食物變應(yīng)原標(biāo)簽和消費(fèi)者保護(hù)法（HR3684H）;歐洲的食物標(biāo)簽管理是依據(jù)EC指令（EU2000）規(guī)定對(duì)含有麥谷蛋白的谷物及其制品、甲殼類動(dòng)物及其制品、蛋類、魚類、花生、大豆、牛奶及乳制品、堅(jiān)果、芝麻、芥末、芹菜和含量大于10mg/kg的亞硫酸鹽等的食物必需在標(biāo)簽中注明過(guò)敏原成份；澳大利亞和新西蘭的食物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（FSANZ）強(qiáng)化了對(duì)食物中過(guò)敏原標(biāo)簽的管理；為保護(hù)消費(fèi)者利益，歐盟法規(guī)(2003/89/EG)規(guī)定，自2005年11月25日起生產(chǎn)者必需在產(chǎn)品標(biāo)簽上標(biāo)明出所有可能致使過(guò)敏反映的成份。隨著全世界經(jīng)濟(jì)一體化和食物貿(mào)易國(guó)際化，花生過(guò)敏問題具有更大的潛在危險(xiǎn)性，為了保障人體健康，規(guī)范產(chǎn)品銷售行為，引導(dǎo)和保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)，成立靠得住、定量的花生過(guò)敏原檢測(cè)方式對(duì)于確保消費(fèi)者的安全十分必要。為保護(hù)消費(fèi)者免受花生過(guò)敏影響，人們成立了諸如火箭免疫電泳法(Rocketimmunoelectrophoresis，RIE)、放射變應(yīng)原吸附實(shí)驗(yàn)(Radioallergosorbentassayinhibition，RAST)、免疫球蛋白免疫印跡(IgE-immunoblotting)、聚合酶鏈?zhǔn)椒从?PolymeraseChainReaction，PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-TimePolymeraseChainReaction，RT-PCR)、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF/MS)、和酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linkedimmunosorbentassays，ELISA)等。其中，酶聯(lián)免疫法應(yīng)用的最為普遍。ELISA是以避免疫學(xué)反映為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反映與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反映在一種固相載體一聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反映物，從而保證明驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。比較常常利用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。Hefle于1994年第一次利用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)花生蛋白，該方式可以用于多種食物中花生蛋白檢測(cè)，檢測(cè)限＜40ppm。ELISA方式是最近幾年來(lái)發(fā)展最快的免疫學(xué)檢測(cè)方式，已經(jīng)成為—種系列化、微量化、商品化的食物安全快速檢測(cè)方式，具有特異性高、敏感性強(qiáng)、快速方便、不需要昂貴儀器設(shè)備等長(zhǎng)處，特別適合檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室利用。3.標(biāo)準(zhǔn)的編制進(jìn)程及方式成立天津市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督查驗(yàn)測(cè)試中心于2008年5月開始承擔(dān)該標(biāo)準(zhǔn)的起草工作，在起草進(jìn)程中，參考引用了r-Biopharm公司RIDASCREEN?FASTPeanut(AOAC認(rèn)可)試劑盒檢測(cè)方式，并經(jīng)研究、改良、驗(yàn)證后肯定本標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)制訂主要工作進(jìn)程如下：在天津市地方標(biāo)準(zhǔn)《花生及制品中過(guò)敏原成份的測(cè)定酶聯(lián)免疫法》(DB12/T300-2006)現(xiàn)有工作基礎(chǔ)上，申報(bào)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；2）制定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)起草工作計(jì)劃；3）標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)參數(shù)修訂及方式驗(yàn)證；4）完成標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿并送專家征求意見；5）總結(jié)反饋意見并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修改；6）報(bào)送全國(guó)糧油標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)。標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督查驗(yàn)測(cè)試中心。標(biāo)準(zhǔn)參加單位：必發(fā)分析系統(tǒng)銷售（北京）有限公司。標(biāo)準(zhǔn)起草人：王永、朱珠、蘭青闊、趙新、程奕、鄭貴忠、郭永澤、張麗華。本標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容說(shuō)明方式原理及適用范圍本方式原理是將樣品與磷酸緩沖鹽溶液混合后加熱以提取樣品中花生蛋白質(zhì)，經(jīng)離心或過(guò)濾后，取部份提取液加到包被了抗體的微孔（吸附抗體）中，溫育時(shí)花生蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合。未結(jié)合的花生蛋白質(zhì)被沖洗掉，再加入酶標(biāo)記的第二種抗體（檢測(cè)抗體），檢測(cè)抗體與已結(jié)合的花生蛋白質(zhì)結(jié)合，經(jīng)第二次沖洗后，加入底物，由于有結(jié)合的檢測(cè)抗體，顯出顏色，加入終止試劑，觀察溶液的顏色。用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定吸光度，按照吸光度值得出樣品中過(guò)敏原成份的殘留量。圖示如下：按照以上原理，咱們用該方式測(cè)定花生、餅干、谷類食物、花生油等中的花生過(guò)敏原成份含量均取得了滿意的結(jié)果。規(guī)范性引用文件本標(biāo)準(zhǔn)中涉及試劑的選購(gòu)、驗(yàn)收、貯存應(yīng)符合GB/T15481《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)用水要達(dá)到GB/T6682《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方式》一級(jí)水規(guī)格。術(shù)語(yǔ)和概念綜合目前國(guó)際對(duì)花生過(guò)敏原的概念，本標(biāo)準(zhǔn)將花生過(guò)敏原概念為〃引發(fā)或激起過(guò)敏反映的花生蛋白質(zhì)，主要由花生球蛋白、伴花生球蛋白組成?！眱x器設(shè)備本標(biāo)準(zhǔn)所選用的儀器設(shè)備系檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室一般性設(shè)備，不存在特殊性。本標(biāo)準(zhǔn)中所有利用的儀器和設(shè)備及器皿，均應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和其它適用標(biāo)準(zhǔn)，并必需是在有效檢定周期內(nèi)和必要的校準(zhǔn)。測(cè)定方式8.5.1樣品制備咱們按照花生及其花生制品花生蛋白存在特點(diǎn)，通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)夕卜有關(guān)文獻(xiàn)，研究成立了采取磷酸鹽緩沖液方式提取蛋白，具體方式是首先將樣品與PBS提取緩沖溶液混合、加熱，混合液經(jīng)離心或過(guò)濾后取得花生蛋白溶液，用這種方式提取花生及其花生制品中的蛋白更簡(jiǎn)單、更快速、提取效率更高。8.5.2方式檢出限按照國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）對(duì)分析方式的檢出限規(guī)定，對(duì)20份空白樣品進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)20份空白樣品測(cè)定值平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)計(jì)算檢測(cè)限。表1檢出限測(cè)定結(jié)果（mg/kg）樣品12345678910平均值標(biāo)準(zhǔn)差檢測(cè)限測(cè)定值樣品11121314151617181920測(cè)定值0由表中可以得出，本項(xiàng)目采用的ELISA檢測(cè)花生過(guò)敏源，檢測(cè)限為kg。8.5.3本方式穩(wěn)定性評(píng)估

為評(píng)估本標(biāo)準(zhǔn)方式的穩(wěn)定性，用不同時(shí)間制備的檢測(cè)試劑(3個(gè)批次)別離對(duì)5個(gè)含有不同濃度的花生過(guò)敏源的質(zhì)控物進(jìn)行測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)誤差、變異系數(shù)及回收率作為穩(wěn)定性的評(píng)估指標(biāo)。變異系數(shù)CV%計(jì)算公式為：CV(%)=SD/Xx100%;其中SD為標(biāo)準(zhǔn)誤差，X為測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值?；厥章视?jì)算公式為：回收率(%)=實(shí)際測(cè)定值/理論值x100%。SD為重復(fù)測(cè)定空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)誤差。結(jié)果見表2。編號(hào)試劑批次ELISA檢測(cè)結(jié)果(mg/kg)質(zhì)控物1質(zhì)控物2質(zhì)控物3質(zhì)控物4質(zhì)控物16(mg/kg)10(mg/kg5(mg/kg)40(mg/kg25(mg/103425))160kg)20446616030508869160平均值(X)69160((X,囑準(zhǔn)偏差69160(SD)裹鼻系ftg)69160(CV，%)收率(％)1071105353由表2中的數(shù)據(jù)可見，本標(biāo)準(zhǔn)采用的檢測(cè)方式，利用不|同批次的檢測(cè)試劑，結(jié)果顯示：回收率的范圍為％--110%，變異系數(shù)為％一%,標(biāo)準(zhǔn)誤差為％一%,檢測(cè)技術(shù)性能參數(shù)符合要求。8.5.4本方式的準(zhǔn)確度和精密度表2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)以3個(gè)濃度花生過(guò)敏原質(zhì)控物添加至不含有花生過(guò)敏原成份的谷類產(chǎn)面粉)和不含有花生過(guò)敏原成份的大豆油中進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置兩個(gè)實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行人員比對(duì)，各重復(fù)測(cè)定6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。表3準(zhǔn)確度和精密度評(píng)估實(shí)驗(yàn)員編號(hào)結(jié)果編號(hào);…g

平均回收率(%)103105標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)變異系數(shù)(CV,%)實(shí)驗(yàn)員編號(hào)結(jié)果編號(hào);…g平均回收率(%)103105平均回收率(%)112標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)變異系數(shù)(CV,%)由表3中數(shù)據(jù)可見，利用本標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方式，兩組實(shí)驗(yàn)人員對(duì)兩種食物基質(zhì)的參考物質(zhì)進(jìn)行花生過(guò)敏源含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)誤差、變異系數(shù)和回收率等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合技術(shù)性能參數(shù)限量標(biāo)準(zhǔn)的要求。8.5.5樣品測(cè)定及檢測(cè)準(zhǔn)確度與精密度依照本方式，選擇6種代表性花生制品類的樣品，通過(guò)大量稀釋后向樣品里面添加定量的花生過(guò)敏源，進(jìn)行日內(nèi)重復(fù)性測(cè)定。每一個(gè)樣品檢測(cè)個(gè)濃度水平，每一個(gè)濃度測(cè)定6次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)誤差、回收率及變異系數(shù)，結(jié)果表明本方式在檢測(cè)

花生及其制品、花生乳飲料時(shí)精密度好，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便，適合推行應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表4。另取3種不含花生過(guò)敏源的樣品，通過(guò)向每種樣品中添加定量的花生過(guò)敏源，

進(jìn)行日內(nèi)重復(fù)性測(cè)定。每一個(gè)樣品檢測(cè)-5個(gè)濃度水平，每一個(gè)濃度隨機(jī)測(cè)定-4次，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)誤差、回收率及變異系數(shù)，結(jié)果表明本方式一樣適用于谷物，巧克力及餅干中的花生過(guò)敏源的檢測(cè)并定量，本方式準(zhǔn)確度高，精密度好，操作簡(jiǎn)便，適合推行應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表。表4花生及其制品中ELISA檢測(cè)準(zhǔn)確度與精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)序試樣添加水平（mg/kg）本底濃度（mg/kg）測(cè)定值（mg/kg）平均值（mg/kg）標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)（%）平均回收率（%）1花生40,,,,,41,2250/,,1012花生醬餅40,,,,,250,,1013海苔花生40,,,106250,,,4怪味花生40,,250,,5乳飲料40,,,103250,,注：樣品測(cè)定范圍須在-20mg/kg范圍內(nèi)，因此表中的測(cè)定數(shù)值為原始值，未乘以稀釋倍數(shù)；表中1號(hào)樣品測(cè)定前稀釋10000倍，2號(hào)稀釋1000倍，3號(hào)樣品稀釋5000倍，4號(hào)樣品稀釋1000倍，5號(hào)樣品稀釋50倍。表5其他樣品中ELISA檢測(cè)準(zhǔn)確度與精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)樣品添加濃度檢測(cè)濃度標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)回收率檢側(cè)次數(shù)谷物3谷物53谷物64谷物2

巧克力5882巧克力3巧克力2巧克力4巧克力102餅干984餅干532923餅干37.本標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方式的外部驗(yàn)證本標(biāo)準(zhǔn)方式已通過(guò)秦皇島出入境查驗(yàn)檢疫局、農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督查驗(yàn)測(cè)試中心（石家莊），遼寧省農(nóng)科院生物技術(shù)所和天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心四家單位進(jìn)行驗(yàn)證明驗(yàn)，驗(yàn)證人員以為：本標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方式靈敏度好、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，適合于實(shí)際樣品的檢測(cè)。四個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)相同的樣品進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)，