雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體公開(kāi)課課件

第12章雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體新民周刊2010,5.17-23.P76-92010.11.2：世界肺炎日（第2個(gè)）全球每年約有160萬(wàn)人死于肺炎鏈球菌疾病，平均每38秒1名5歲下兒童死于此病，1100萬(wàn)兒童因肺炎住院。中國(guó)是10個(gè)肺炎發(fā)病率最高的國(guó)家之一，1/4兒童攜帶病菌；死亡兒童該病占46.8%。占西太平洋區(qū)的70%。紅霉素不敏感幾乎達(dá)到100%，青霉素達(dá)86%。1983年23價(jià)肺炎鏈球菌夾膜多糖疫苗PPV23誕生。2000年針對(duì)2歲以下兒童的7價(jià)肺炎鏈球菌蛋白結(jié)合疫苗PPV7問(wèn)世。目前已經(jīng)接種3億劑，世界第一大單個(gè)疫苗。2003年SARS病毒SARS病毒屬于冠狀病毒科，病毒粒子多呈圓形，有囊膜，外周有冠狀排列的纖突，病毒直徑在80-120nm之間。感染病毒的細(xì)胞線粒體腫脹，部分線粒體外膜或嵴溶解，病毒顆粒主要分布在胞漿的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池、胞漿空泡內(nèi)和細(xì)胞外，多聚集成堆。12-1

雜交瘤技術(shù)將骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞融合得到即能夠分泌抗體又能在體外長(zhǎng)期繁殖的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)克隆化培養(yǎng)得到可以分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，這種技術(shù)通稱為雜交瘤技術(shù)（hydridomatechnique）。歷史發(fā)現(xiàn)1975年，英國(guó)劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）進(jìn)行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征：即像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無(wú)限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體。科勒（Kohler）米爾斯坦（Milstein）（一）免疫學(xué)基礎(chǔ)1抗原：進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)對(duì)肌體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用的外源物質(zhì)。包括：蛋白質(zhì)、多糖、核酸、病毒、細(xì)菌、各種細(xì)胞等。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)表位性（抗原決定簇

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單克隆抗體免疫原特異性：（抗原與抗體的反應(yīng)）抗原---刺激免疫系統(tǒng)---發(fā)生免疫應(yīng)答-----產(chǎn)生應(yīng)答產(chǎn)物。18T細(xì)胞與B細(xì)胞抗原決定簇的比較2抗體互補(bǔ)性決定區(qū)（Complementaritydeterminingregion，CDR）VH和VL的三個(gè)高變區(qū)共同組成Ig的抗原結(jié)合部位。該部位形成一個(gè)與抗原決定簇互補(bǔ)的表面，決定抗體的多樣性與特異性。動(dòng)物免疫系統(tǒng)分泌的中和或消除抗原物質(zhì)的影響的物質(zhì)，存在于血清中，本質(zhì)是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。?C：constantregion?V：variableregion抗體的來(lái)源免疫系統(tǒng)：包括體液免疫和細(xì)胞免疫，參與的細(xì)胞包括B淋巴細(xì)胞——發(fā)育成漿細(xì)胞，分泌抗體，參與體液免疫，脾臟可以分泌。T淋巴細(xì)胞——發(fā)育成吞噬細(xì)胞，直接參與細(xì)胞免疫，經(jīng)胸腺分泌。不能產(chǎn)生抗體，幫助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體。問(wèn)題的引出血液得到的只能是混合抗體，但是需要大量的僅針對(duì)某一個(gè)抗原決定族的單克隆抗體，幾乎是不可能的，因此必須采用其他方法。3單克隆抗體生產(chǎn)途徑：細(xì)胞融合：雜交瘤細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)化：獲得永久生長(zhǎng)的B淋巴細(xì)胞視頻：d_XMTY1ODg5MDI0.html(三）雜交瘤制備單克隆抗體單克隆抗體技術(shù)分非特異性、特異性兩類2.骨髓瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)與篩選骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫B淋巴細(xì)胞源于同一品系動(dòng)物（如BALB/C小鼠），這樣雜交融合率高。通常采用HPRT（次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）與TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞系。HPRT和TK兩種酶參與DNA補(bǔ)救途徑合成。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開(kāi)始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，用老鼠巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期骨髓瘤細(xì)胞，進(jìn)行HAT液敏感性篩選培養(yǎng)。HAT培養(yǎng)基篩選法培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。HAT篩選原理DNA的合成：正常途徑：糖、氨基酸——核苷酸——DNA，可以被氨基蝶呤阻斷胸腺嘧啶核苷激酶（TK）補(bǔ)救途徑：核苷酸前體——核苷酸——DNA

次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）需要2種酶的參與4融合細(xì)胞的篩選融合的B淋巴細(xì)胞和瘤（雜交瘤）細(xì)胞、融合的B淋巴細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞、未融合的B淋巴細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體等。正常的B淋巴細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅5～7天，無(wú)需特別篩選，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。剩余：B淋巴細(xì)胞與瘤細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞+未融合的瘤細(xì)胞+融合的瘤細(xì)胞，其中后兩種需進(jìn)行特別的HAT液培養(yǎng)篩選去除。融合后的細(xì)胞類型：（1）氨基蝶呤可阻斷細(xì)胞正常途徑合成DNA，因此HAT培養(yǎng)基上的細(xì)胞不能采用該途徑合成DNA。（2）融合的瘤細(xì)胞一般是HPRT與TK缺陷型，因此也不能采用補(bǔ)救途徑合成DNA。兩條途徑被阻斷后，有怎樣的結(jié)果呢？瘤細(xì)胞（未融合的和多聚體）命運(yùn)：因不能正常合成DNA而死亡。融合雜交瘤細(xì)胞：具有親代雙方的遺傳性能，具有來(lái)自于淋巴細(xì)胞內(nèi)的HPRT與TK，因此可利用培養(yǎng)基中的嘌呤與嘧啶采用補(bǔ)救途徑合成DNA，因此可在HAT培養(yǎng)基中存活與繁殖。HAT篩選雜交瘤細(xì)胞H,次黃嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶5.雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)將融合的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的數(shù)個(gè)細(xì)胞之間，培養(yǎng)。取上清以ELISA法篩選出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體分泌性高的雜交瘤細(xì)胞株，增殖后凍存。7.單克隆抗體的大量制備（1）血清法對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞按1～3×107cells／ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般10～20天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mg／ml。缺點(diǎn)是采血量有限。（一）體內(nèi)接種法（2）腹水制備法腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5～20mg/ml，這是目前最常用的方法。人—鼠雜交瘤：融合方法基本與鼠—鼠雜交瘤相同。親本骨髓瘤細(xì)胞是小鼠骨髓瘤細(xì)胞，親本B細(xì)胞則來(lái)源于人外周血淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、脾細(xì)胞。但是，人—鼠雜交瘤的人單克隆抗體分泌性能很不穩(wěn)定，多數(shù)情況下雜交瘤會(huì)很快失去抗體分泌能力