植物組織培養(yǎng)7課件

第八章原生質(zhì)培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交主要內(nèi)容植物原生質(zhì)培養(yǎng)的目的和意義原生質(zhì)分離體細(xì)胞雜交原生質(zhì)體培養(yǎng)一、植物原生質(zhì)培養(yǎng)的目的和意義1、原生質(zhì)體(protoplast)：指除去細(xì)胞壁的細(xì)胞或是說一個(gè)被質(zhì)膜所包圍的裸露細(xì)胞。亞原生質(zhì)體(subprotoplast)：在原生質(zhì)體分離過程中，有時(shí)會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)含物的斷裂而形成一些較小的原生質(zhì)體就叫做亞原生質(zhì)體。它可以具有細(xì)胞核或沒有細(xì)胞核。核質(zhì)體(nuclearplast)：由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體(miniprotoplast)。胞質(zhì)體（cytoplast）：不含細(xì)胞核而僅含有部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已有49個(gè)科，160個(gè)屬的360多種植物經(jīng)原生質(zhì)體培養(yǎng)得到了再生植株。其趨勢仍以農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物為主，但從一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物擴(kuò)展。

二、原生質(zhì)體分離1、植物原生質(zhì)體的分離方法

（1）原生質(zhì)體的機(jī)械制備

（2）原生質(zhì)體的酶法分離（2）Enzymaticalpreparationofprotoplasts

Basictechnique:二、影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的因子1、材料的來源2、前處理3、酶處理4、滲透壓溫室或生長室栽種的植物

一般生長在下述條件下的植株能產(chǎn)生較好的效果:低光照強(qiáng)度1000lx,短日照,溫度范圍20-25度,相對濕度60%-80%,以及充足的氮肥供應(yīng).

禾本科和其他一些物種的葉肉細(xì)胞難以分離原生質(zhì)體,因此在這些植物中一直利用培養(yǎng)細(xì)胞作為供體材料.2.前處理A、材料用黑暗處理、低溫處理和不同光質(zhì)照射、材料的預(yù)培養(yǎng)等方法，可提高某些材料原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。不同植物及材料類型預(yù)處理方法不同。龍膽試管苗只有用低溫處理原生質(zhì)體才能分裂；甘蔗植株只有現(xiàn)在黑暗條件下培養(yǎng)12小時(shí)后分離的原生質(zhì)體才能分裂；馬鈴薯試管苗葉片需在黑暗下處理48小時(shí)后分離原生質(zhì)體，才會(huì)獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量。B、消毒C、保證酶解充分進(jìn)行，促使酶溶液滲入到葉片的細(xì)胞間隙中。方法：1.撕去葉片的下表皮，然后以無表皮的一面向下，使葉片漂浮在酶溶液中；2.把葉片或組織切成小塊，投入到酶溶液中，可與真空滲入相結(jié)合。A、纖維素酶目前市場上主要有日本生產(chǎn)的分解細(xì)胞壁較好的纖維素酶：Onozuka、Meicelase、Driselase。纖維素酶Onozuka根據(jù)活力高低又分為P1500、P500和R-10等數(shù)種。主要含有纖維素酶C1（作用于天然的和結(jié)晶的纖維素）、纖維素酶Cx，纖維素二糖酶，木聚糖酶、葡聚糖酶果膠酶、脂肪酶、核酸酶、溶菌酶等。

B、半纖維素酶制劑可以降解半纖維素為單糖或單糖衍生物。常用的是RhozymeHp150

C、果膠酶是從根霉中提取的，使細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解，把細(xì)胞從組織內(nèi)分離出來。常用的果膠酶有MacerozymeR-10（離析酶，主要成分是果膠酶），此酶的活性較高，但含雜酶也較多，如使用濃度過高，時(shí)間過長，則有毒害作用。PectalyaseY-23（離析軟化酶），此酶活性極高，一般葉片使用量為0.1%，懸浮細(xì)胞0.05%

原生質(zhì)體分離常用的商品酶

酶來源生產(chǎn)廠家纖維素酶類onozukaR–10綠色木霉YakultHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanCellulysin綠色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA92037,USADriselaseIrpexlutensKayowaHakkoKogyoCo.,Tokyo,Japan果膠酶類MacerozymeR-10根霉YakyltHonshaCo.Ltd.,Tokyo,JapanPectinase黑曲霉SigmaChemicalCo.,St.Louit,MO63178,USAPectolyaseY-23黑曲霉SeishinPharm.Co.Ltd.,Tokyo,Japan半纖維素酶RhozymeHP-150黑曲酶RohmandHassCo.,Philadelphia,PA19105,USAHemicellulase黑曲霉SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO63178,USA

酶濃度植物材料須按比例和酶液混合才能有效地游離原生質(zhì)體，一般去表皮的葉片需酶量較少，而懸浮細(xì)胞則用酶量較大。

酶解時(shí)間\酶解溫度酶解處理一般地在黑暗中靜止進(jìn)行，在處理過程中偶爾輕輕搖晃幾下。對于懸浮細(xì)胞，愈傷組織等難游離原生質(zhì)體的材料，可置于搖床上，低速振蕩以促進(jìn)酶解。酶解時(shí)間幾小時(shí)至幾十小時(shí)不等、以原生質(zhì)體游離下來為準(zhǔn)。但是，時(shí)間過長對原生質(zhì)體有害，所以一般不應(yīng)超過24h。酶解溫度要從原生質(zhì)體和酶的活性兩方面考慮。對于這幾種酶來說，最佳處理溫度在40~50℃．但這個(gè)溫度對植物細(xì)胞來說太高，所以一般都在25℃左右進(jìn)行酶解。

酶溶液的pH值對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和生活力影響很大。用菜豆葉片作培養(yǎng)材料時(shí)，發(fā)現(xiàn)原始pH值為5．0時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)生得很快，但損壞較嚴(yán)重，并且培養(yǎng)后大量破裂。當(dāng)pH值提高到6．0時(shí)，最初原生質(zhì)體卻產(chǎn)生少，但與pH值為5．0時(shí)處理同樣時(shí)間后相比，原生質(zhì)體數(shù)量顯著增加。高活性低低原生質(zhì)體損壞多纖維素酶，pH5.4，果膠酶5.8，兩種混合5.4~5.6

酶液pH值：4.7-5.8，常用的兩種系統(tǒng)為①糖溶液系統(tǒng)：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，濃度約在0.40~0.80mmol／L。本系統(tǒng)還可促進(jìn)分離的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁并繼續(xù)分裂；②鹽溶液系統(tǒng)：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。其優(yōu)點(diǎn)是獲得的原生質(zhì)體不受生理狀態(tài)的影響，因而材料不必在嚴(yán)格的控制條件下栽培，不受植株年齡的影響，使某些酶有較大的活性使原生質(zhì)體穩(wěn)定。另外，添加牛血清蛋白可減少或防止降解壁過程中對細(xì)胞器的破壞。近年來多采用在鹽溶液內(nèi)進(jìn)行原生質(zhì)體分離，然后再用糖溶液作滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

A、兩步法分離植物原生質(zhì)體

先用果膠酶離析植物組織，使植物細(xì)胞從組織中分離出來，然后收集細(xì)胞洗滌后用纖維素酶解離細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體

B、一步法分離

把一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對材料進(jìn)行一次性處理。

三、Purificationoftheisolatedprotoplasts

酶解后的混合物包括：解離酶液中，有原生質(zhì)體，有破碎細(xì)胞的細(xì)胞器等，也有未解離的組織或細(xì)胞。而培養(yǎng)只要干凈的原生質(zhì)體。所以要進(jìn)行純化。凈化的方法：A、清除較大碎屑：酶解后的混合物穿過一個(gè)鎳絲網(wǎng)（50-70um）

B、清除較小的物質(zhì)：1.沉降法2.漂浮法3.界面法1.沉降法

鎳絲網(wǎng)濾出液置于離心管（離心2-3分鐘，原生質(zhì)體沉于離心管底部，殘液碎屑懸浮于上清液）棄去上清液再把沉淀物重新懸浮于清洗培養(yǎng)基中（反復(fù)3次）常用的清洗培養(yǎng)基CPW鹽溶液成分（mg/l）KH2PO427.2KI0.16KNO3101.0CuSO4.5H2O0.025CaCl2.2H2O1480.0pH5.8MgSO4.7H2O246.0轉(zhuǎn)速的控制以將原生質(zhì)體沉淀而細(xì)胞碎片等雜質(zhì)仍懸浮在上清液中為準(zhǔn)，一般于500~800r/m的轉(zhuǎn)速下離心3~5min。用吸管小心的吸掉上清液，用洗滌液洗滌三次，然后用培養(yǎng)基將原生質(zhì)體調(diào)整到一定密度后進(jìn)行培養(yǎng)。

2.漂浮法

根據(jù)原生質(zhì)體來源不同，利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質(zhì)體漂浮其上，殘?jiān)樾汲恋焦艿住?.界面法原生質(zhì)體純化以柑桔為例25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液Purifiedprotoplasts四、原生質(zhì)體活力測定

目測法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動(dòng)性確定原生質(zhì)體活力。

如形態(tài)上完整，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色新鮮的原生質(zhì)體即為存活的。

FDA法：

伊凡藍(lán)法：伊凡藍(lán)不能穿過質(zhì)膜，只有質(zhì)膜受到嚴(yán)重?fù)p壞使，細(xì)胞才能被染色，因而可以通過細(xì)胞被染色與否確定活性。影響原生質(zhì)體活力的因素分離材料的生理狀態(tài)酶解條件：酶質(zhì)量、濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶溶液的滲透壓分離條件：離心次數(shù)、離心速度、純化方法、分離持續(xù)時(shí)間環(huán)境條件：操作環(huán)境的溫度、分離用具的影響第三節(jié)原生質(zhì)體的培養(yǎng)供體植物的選擇原生質(zhì)體的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件培養(yǎng)方法細(xì)胞分裂與愈傷組織形成細(xì)胞壁的形成植株的再生影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素一、原生質(zhì)體的培養(yǎng)基1．在多數(shù)情況下原生質(zhì)體所用的基本培養(yǎng)基為NT，KM，DPD、MS、B52．無機(jī)鹽大量元素濃度；（一般要低于愈傷組織培養(yǎng)基）NO3－和NH4+的比例；（降低NH4+、NO3－增加有機(jī)氮）Ca2+濃度（增加，適當(dāng)?shù)臐舛?，能提高分裂?xì)胞的百分?jǐn)?shù)）3．有機(jī)成分維生素、氨基酸、糖（常用葡萄糖，過濾滅菌）及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白

4．激素常用的激素：NAA、IAA、2,4-D（先高后低）與BA5．pH值二、培養(yǎng)條件

最初4-7天分離出來的原生質(zhì)體應(yīng)在黑暗中培養(yǎng)（對光很敏感，少做觀察）；當(dāng)細(xì)胞壁完整形成后，細(xì)胞具有耐光的特性，這時(shí)轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)。

溫度一般為27-29度三、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法1.液體淺層培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。一般直徑3cm加1-1.5ml培養(yǎng)液，6cm加2-3ml優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。缺點(diǎn)：是原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進(jìn)一步生長與發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個(gè)細(xì)胞的發(fā)育情況。液體淺層培養(yǎng)用培養(yǎng)基離心用培養(yǎng)基懸浮2.固體平板培養(yǎng)基也是瓊脂糖包埋培養(yǎng)。低融點(diǎn)的瓊脂糖可在30度左右融化與原生質(zhì)體融合而不影響原生質(zhì)體的生命活動(dòng)?；旌虾蟮暮性|(zhì)體的培養(yǎng)基鋪于培養(yǎng)皿底部，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：可以跟蹤觀察單個(gè)原生質(zhì)體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體分裂頻率。缺點(diǎn)：操作要求嚴(yán)格，尤其是混合的溫度掌握必須合適，溫度偏高則影響原生質(zhì)體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快，原生質(zhì)體不容易混合均勻。3.液體-固體雙層培養(yǎng)即在培養(yǎng)皿低部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質(zhì)體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。優(yōu)點(diǎn)：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。缺點(diǎn)：不易觀察細(xì)胞的發(fā)育過程。在體細(xì)胞雜交和誘發(fā)突變的研究中，最好能獲得個(gè)別細(xì)胞的無性系，因此需要低密度（每毫升培養(yǎng)基100-500個(gè)原生質(zhì)體）。

1.培養(yǎng)基Kao等配置了一種復(fù)雜的培養(yǎng)基，即KM8p培養(yǎng)基。2.培養(yǎng)方法a、飼養(yǎng)層培養(yǎng)

X-射線照射原生質(zhì)體，與0.6%瓊脂混合，在培養(yǎng)皿中鋪成平板，作為飼養(yǎng)層，再將生活力正常的原生質(zhì)體與0.6%瓊脂混合，培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上。

b、共培養(yǎng)法

將生長迅速的原生質(zhì)體培養(yǎng)物與難于培養(yǎng)的原生質(zhì)體混合.

前者為后者提供生長因素或成分未知但能促進(jìn)生長的擴(kuò)散型化學(xué)物質(zhì).五、原生質(zhì)體的發(fā)育與植株再生細(xì)胞壁再生細(xì)胞分裂與生長愈傷組織形成與分化植株再生1.細(xì)胞壁再生原生質(zhì)體將失去它們特有的球形外觀,這種變化被視為再生新壁的象征.一般原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后開始再生新的細(xì)胞壁,一至數(shù)天便可形成完整的細(xì)胞壁.證明細(xì)胞壁再生的方法:

卡氏白染色（熒光增白劑，CFW）:能與細(xì)胞壁物質(zhì)β-葡萄糖苷鍵結(jié)合,能發(fā)出熒光.電鏡觀察法:新形成的細(xì)胞壁是排列松散的微纖絲組成的,微纖絲的合成是發(fā)生在質(zhì)膜的表面.電鏡觀察發(fā)現(xiàn),原生質(zhì)體培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后,新壁開始形成,先是質(zhì)膜合成形成細(xì)胞壁主要成分的微纖絲,然后轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面進(jìn)行聚合作用,產(chǎn)生片層的結(jié)構(gòu),以后在質(zhì)膜與片層之間或在膜上產(chǎn)生纖微絲,逐漸形成不定向的纖維團(tuán),最后形成完整的細(xì)胞壁.細(xì)胞壁的形成與細(xì)胞分裂有直接關(guān)系,凡是不能再生細(xì)胞壁的原生質(zhì)體也就不能進(jìn)行正常的有絲分裂.2.細(xì)胞分裂與生長一般原生質(zhì)體培養(yǎng)2-7天后,開始第一次分裂,但開始第一次分裂的時(shí)間隨植物的種類,分離原生質(zhì)體的材料,原生質(zhì)體的質(zhì)量,培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異.用幼苗的下胚軸和子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞、未成熟種子的子葉等為材料分離的原生質(zhì)體；一般比用葉肉分離的原生質(zhì)體容易誘導(dǎo)分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時(shí)間較快。3.愈傷組織形成與分化大多數(shù)情況下，原生質(zhì)體培養(yǎng)2周后，形成多細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，三周后形成肉眼可見的小細(xì)胞克隆，大約6周后形成直徑為2mm的小愈傷組織。原生質(zhì)體培養(yǎng)7-10天后必須及時(shí)添加新鮮培養(yǎng)基，否則形成的細(xì)胞團(tuán)不繼續(xù)生長。待小愈傷組織長至1mm左右時(shí)應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上進(jìn)一步生長。4.植株的再生原生質(zhì)體形成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上可一步成苗。然而越來越多實(shí)驗(yàn)證明，兩步法成苗更適合大多數(shù)植物的原生質(zhì)體再生植株。即首先將愈傷組織培養(yǎng)于含低濃度生長素培養(yǎng)基上，讓其增殖和調(diào)整狀態(tài)，再其轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化成苗。六、原生質(zhì)體研究的趨勢低密度和單個(gè)原生質(zhì)體培養(yǎng)；原生質(zhì)體衍生系統(tǒng)如微小原生質(zhì)體、胞質(zhì)體、核質(zhì)體的利用；單倍配子體如花粉原生質(zhì)體培養(yǎng)；計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)、流式細(xì)胞光度計(jì)等技術(shù)的應(yīng)用。第四節(jié)體細(xì)胞雜交體細(xì)胞雜交是指兩個(gè)離體細(xì)胞通過一定誘導(dǎo)技術(shù)使質(zhì)膜接觸而融合在一起隨后導(dǎo)致兩個(gè)細(xì)胞核物質(zhì)融合的技術(shù)。

理論上說任何細(xì)胞,都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源,這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義.Fusionphasesofoatprotoplasts(Avenasativa)A.融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機(jī)制的限制,為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供有效途徑;B.體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種,細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng),在雜種的分裂和增殖過程中，雙親的葉綠體、線粒體、DNA、亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。根據(jù)融合時(shí)細(xì)胞的完整程度，原生質(zhì)體融合可分為兩大類：對稱融合（asymmetricfusion）－即兩個(gè)完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。非對稱融合（symmetricfusion）－利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合，它可以分為幾種：對稱融合示意圖

非對稱融合的附圖非對稱融合示意圖物理方法常采用射線處理，如X射線、射線等，它們能使細(xì)胞核失活；化學(xué)處理目前常用的試劑有:

核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質(zhì)失活－羅丹明（R－6－G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達(dá)到失活的目的用于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)失活的方法分為物理和化學(xué)兩大類：1978年德國科學(xué)家梅歇爾斯等人把馬鈴薯(potato)和番茄(tomato)的原生質(zhì)體融合獲得了體細(xì)胞雜種“泡馬豆”（pomato)

一、融合方法PEG誘導(dǎo)融合法

PEG的作用機(jī)理：

由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，當(dāng)PEG分子鏈足夠長時(shí)，在相鄰原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連。與膜相連的PEG分子被洗掉后，膜上電荷發(fā)生紊亂而重新分配。當(dāng)兩層膜緊密接觸的區(qū)域電荷重新分配時(shí)，可能使一種原生質(zhì)體上的帶正電荷的基團(tuán)連接到另一種原生質(zhì)體的帶負(fù)電荷的基團(tuán)上，進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。

-+-+-橋梁++--PEG被洗掉++--電荷重排++--原生質(zhì)體膜接觸++-融合示意圖PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn):融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點(diǎn):融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害。

融合液：CaCl2·2H2O8~10mmol

KH2PO40.7mmol

甘露醇或山梨醇0.5~1.0mol

pH5.6

誘導(dǎo)液：融合液＋PEG20～45％

稀釋液：A液（g/100ml）pH6.0

B液（g/100ml）pH10.5

葡萄糖7.21甘氨酸0.375

CaCl2·2H2O0.79NaOH0.169

DMSO（二甲亞砜）10mlP1融合液P2混合靜止1min.選擇P1P2加入PEG培養(yǎng)融合加入稀釋液加入培養(yǎng)基稀釋洗滌2、電融合法

1979年：Senda首先實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體融合

交流電使原生質(zhì)體排成串珠

直流電使原生質(zhì)體質(zhì)膜發(fā)生不可逆擊穿與PEG融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點(diǎn)：一是不存在對細(xì)胞的毒害問題；二是融合效率高；三是融合技術(shù)操作簡便。

電融合儀的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：

一是交變電場部分；一是高頻直流電擊部分。電融合的基本過程：

細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。關(guān)于融合參數(shù)：電融合中的主要參數(shù)包括交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電場的處理時(shí)間；直流高頻電壓、脈沖寬度、脈沖次數(shù)等。電融合法原理交流電場使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠+

-+

-+

-+

-+

-+

-負(fù)極正極+-+-+-+-+-施加直流電場后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-二、原生質(zhì)體融合的過程包括3個(gè)主要階段：1、凝聚作用階段，其間兩個(gè)或兩個(gè)以上的原生質(zhì)體的質(zhì)膜彼此靠近；2、在很小的局部區(qū)域質(zhì)膜緊密粘連，彼此融合，在兩個(gè)原生質(zhì)體之間細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)連續(xù)狀態(tài)，或是出現(xiàn)橋；3、由于細(xì)胞質(zhì)橋的擴(kuò)展，融合完成，形成球形的異核體或同核體。三、影響原生質(zhì)體融合的因素首先，原生質(zhì)體質(zhì)量對細(xì)胞的融合起著至關(guān)重要的作用，高質(zhì)量的原生質(zhì)體是細(xì)胞融合的首要條件。其次，融合方法首選電融合、如果沒有條件進(jìn)行電融合，可以考慮PEG融合其三是融合參數(shù)，包括各種融合液都應(yīng)選擇適當(dāng)。原生質(zhì)體融合后的培養(yǎng)同原生質(zhì)體培養(yǎng)四、雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)與雜種植株的鑒定

1、雜種細(xì)胞的篩選原理：兩種親本細(xì)胞融合的混合物中可能有多種類型細(xì)胞，篩選的目的是獲得優(yōu)良的雜種細(xì)胞。1）親本

2）同核體：同源原生質(zhì)體的融合體3）異核體：非同源的原生質(zhì)體的融合體4）多核體：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體

5）異胞質(zhì)體：具有不同胞質(zhì)來源的雜合細(xì)胞。

6）核質(zhì)體：有細(xì)胞核而帶有少量細(xì)胞質(zhì)的亞原生質(zhì)體植物細(xì)胞篩選方式1）遺傳互補(bǔ)篩選法：

利用每一親本貢獻(xiàn)一個(gè)功能正常等位基因，糾正另一親本的缺陷，令雜種細(xì)胞表現(xiàn)正常。如親本1：葉綠體缺陷型親本2：光致死型兩親本在光照下一種死亡，另一種呈白色，融合細(xì)胞長成植株呈綠色，并能成長2）抗性互補(bǔ)篩選法：利用親本細(xì)胞原生質(zhì)體對抗生素、除草劑及其它有毒物質(zhì)抗性差異選擇雜種細(xì)胞。如：親本1：對放線菌素D抗性，但在MS培養(yǎng)基上不能超過50個(gè)世代親本2：對放線菌素D很敏感，但能在MS上生長雜種細(xì)胞能在含有放線菌素的MS培養(yǎng)基上生長，而親本和其它細(xì)胞死亡3）利用物理特性篩選法：

根據(jù)親本的原生質(zhì)體大小、顏色、漂浮密度及電泳遷移率、形成的愈傷組織的差異篩選雜種細(xì)胞。

親本1：異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記

親本2：堿性蕊香紅熒光素標(biāo)記

在熒光顯微鏡下，親本1為綠色，親本2為紅色色，雜種細(xì)胞可以區(qū)分

4）利用生長特性篩選法：

利用原生質(zhì)體對培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞。例如粉蘭煙草與朗氏煙草細(xì)胞原生質(zhì)體均需外源激素才能生長，但其融合細(xì)胞可以產(chǎn)生內(nèi)源激素，在培養(yǎng)基上不需加激素。2、體細(xì)胞雜種的鑒定

形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學(xué)性狀觀察進(jìn)行鑒定。

細(xì)胞學(xué)鑒定：細(xì)胞器鑒定、染色體鑒定。

生化鑒定：同功酶鑒定。

分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標(biāo)記鑒定。

2-1、形態(tài)學(xué)

比較再生植株與融合親本在形態(tài)上的異同

2-2、細(xì)胞學(xué)

染色體形態(tài)和數(shù)目的比較18條染色體36條染色體五、體細(xì)胞雜種的特點(diǎn)形態(tài)上的趨中性變異幅度大非整倍性雙親性狀的共顯性偏親現(xiàn)象六、體細(xì)胞雜種的遺傳特性