噬菌體載體和柯斯載體優(yōu)秀課件

第五章噬菌體載體和柯斯載體本章主要內(nèi)容噬菌體一般特性λ噬菌體柯斯質(zhì)粒M13噬菌體1、M13噬菌體特性及基因組結(jié)構(gòu)2、M13噬菌體載體類型及特點噬菌粒比較第一節(jié)噬菌體的一般生物學(xué)特性（Bacteriophage，phage）

噬菌體可以在脫離寄主細胞的狀態(tài)下保持生命，但一旦脫離了寄主細胞，就不能生長和復(fù)制利用寄主的核糖體、蛋白質(zhì)合成因子、氨基酸和產(chǎn)能體系，進行生長和繁殖一、噬菌體的結(jié)構(gòu)和其核酸類型結(jié)構(gòu)：無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型、線狀體型核酸類型：最常見的是雙鏈線性DNA、雙鏈環(huán)形DNA、單鏈環(huán)形DNA、單鏈線形DNA、單鏈RNA。不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。大分子量的噬菌體生命周期比較復(fù)雜；對寄主的依賴性較低有些噬菌體的DNA堿基不是由標(biāo)準(zhǔn)的A/T/C/G組成的。

Example：

T4噬菌體DNA沒有C堿基，取代的是5-羥甲基胞嘧啶（HMC）；SP01噬菌體DNA中沒有T堿基，取代的是5-羥甲基尿嘧啶（HMU）。噬菌體的感染過程尾部粘至細胞壁尾部蛋白質(zhì)收縮核酸注入細菌利用細菌的RNA聚合酶和核糖體翻譯得到噬菌體蛋白使細菌的DNA降解合成自身的DNA至數(shù)百個拷貝合成頭部尾部蛋白進行組裝三、噬菌體的溶菌生命周期噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。烈性噬菌體溶菌生長的基本過程：1、吸附吸附到位于感染細胞表面的特殊接受器上2、注入噬菌體DNA穿過細胞壁注入寄主細胞3、轉(zhuǎn)變被感染的細胞成為制造噬菌體顆粒的場所4、合成大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質(zhì)5、組裝包裝了DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒6、釋放子代噬菌體顆粒從寄主細胞內(nèi)釋放出來1、概念溫和噬菌體：既能進入溶菌生命周期又能進入溶源生命周期。溶源性細菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細菌溶源化：用溫和噬菌體感染細菌培養(yǎng)物使之形成溶源性細菌的過程整合：噬菌體的DNA是被包容在寄主細胞染色體DNA中原噬菌體：在溶源細菌內(nèi)存在的整合的或非整合的噬菌體超感染免疫性：溶源性細菌不能夠被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染。2、溶源周期的主要特征λ噬菌體和P1噬菌體λ噬菌體的特征：(1)噬菌體的DNA分子注入細菌細胞(2)經(jīng)過短暫的轉(zhuǎn)錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉(zhuǎn)錄活性便被一種阻遏物所關(guān)閉(3)噬菌體的DNA分子插入到細菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體(4)細菌繼續(xù)生長、增值，噬菌體的基因作為細菌染色體的一部分進行復(fù)制。噬菌體P1基本特征：不存在噬菌體DNA分子的整合作用體系，而是變成了一種進行獨立復(fù)制的環(huán)形的質(zhì)粒DNA分子。3、超感染免疫性（1）溶源細菌的兩個重要特點：不能被頭一次感染的噬菌體再次感染，稱為超感染免疫性；經(jīng)過許多世代以后，溶源性細菌可以進入溶菌周期，稱為溶源性誘發(fā)。①超敏感免疫性阻遏－操縱體系：cⅠ基因編碼阻遏蛋白，啟動子PL和PR，操縱基因OL和OROLPLcⅠPROR阻遏蛋白同操縱基因結(jié)合使RNA聚合酶不能起始轉(zhuǎn)錄，這種狀態(tài)有充分的能力使原噬菌體保持“關(guān)閉”形式，溶源細菌能夠正常生長。整合酶必須首先與宿主編碼的宿主整合因子(hostintegrationfactor，Hif)結(jié)合形成復(fù)合體，才能催化attP和attB在O區(qū)進行重組而形成原噬菌體。Hif五、重組噬菌體的分離大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期?加入λ噬菌體懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時?用新鮮培養(yǎng)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時?高速離心，沉淀噬菌體?苯酚抽提，釋放λ-DNA?乙醇或異丙醇沉淀DNA。back1、λ噬菌體特性及基因組結(jié)構(gòu)2、λ噬菌體載體類型及特點第二節(jié)λ噬菌體載體backλphage一、λ噬菌體的分子生物學(xué)概述1、基因組結(jié)構(gòu)（1）cos位點線性雙鏈DNA分子兩端各有一條12nt組成的彼此完全互補的5’突出單鏈注入宿主后，粘性末端互補形成雙鏈區(qū)，成為cos位點。左側(cè)區(qū)A～J中間區(qū)J～N右側(cè)區(qū)N右側(cè)（2）基因組COSAWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSR

attintxis

gamredcIIIN

COS頭部基因尾部基因功能不明區(qū)溶源化重組早期控制阻遏DNA合成溶菌生長非必要區(qū)段cI基因：溶源過程控制基因λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)感染早期：從單一復(fù)制起點開始雙向θ型復(fù)制，由O基因和P基因產(chǎn)物激活；隨后開始滾環(huán)復(fù)制，產(chǎn)生的線性DNA為基因組首尾串連的多聯(lián)體DNA分子①DNA復(fù)制——O基因和P基因早期蛋白表達θ型復(fù)制cos早期蛋白不表達，晚期蛋白表達②溶源化控制基因——attintxisXis：控制一種蛋白質(zhì)刪除酶的合成int：控制整合酶的合成att：提供整合酶的識別位點③控制基因cIII、N、cI、cro、cII④溶菌基因——S、RDNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)λphage12bp1、插入式載體一種只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點的派生載體。只能插入較小分子量的外源（＜10kb），廣泛用于cDNA及小片段DNA的克隆2、替換型載體（取代型載體）具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。可以克隆較大分子量的外源，克隆高等真核生物DNA二、λ噬菌體載體的主要類型（一）插入式載體λ噬菌體載體相對于質(zhì)粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫或基因組文庫的構(gòu)建。1、cI基因插入失活如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶源化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。

cIEcoRI

LA32.7RA10.6

λgt10

λgt10LacZ基因插入失活：如charon16A，λgt11載體，在非必需區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRⅠ位點，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

lacZLA19.9RA21.9EcoRIcharon16A（二）λ替換型載體（取代型載體）外源DNA取代噬菌體染色體中對于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段

(~20kb)高感染效率(109

轉(zhuǎn)化株/ug

載體DNA，比質(zhì)粒高100-倍)替換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。eg:

EMBL3,DASH

Charon4A載體

Charon4A載體是用Lac5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的LacZ）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時將Lac5作為選擇標(biāo)記使用時用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑Lac5

EcoRICharon4A

λEMBL3/4、Charon40

Charon40的中間可取代區(qū)段是一種DNA短片段多次重復(fù)而成，稱為多節(jié)段區(qū)，兩個短片段之間可被NaeⅠ識別，因此用它做載體可以有效的將其中的多節(jié)段區(qū)清除，從而得到的多是重組的噬菌體?？寺∧芰_到9～22kb短片段重復(fù)替換區(qū)

MCSMCSCharon40LA19.2RA9.6在λNM781替換型載體中，可取代的EcoRⅠ片段，編碼有一個supE基因（大腸桿菌突變體tRNA基因），這種λNM781噬菌體感染細胞后，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變被抑制，因此能在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍色的噬菌斑。如果這個具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述指示培養(yǎng)基上只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑。λNM781替換型載體克隆外源DNA的步驟1、應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化λ載體，除去可取代的DNA片段；2、將上述所得的

λDNA載體臂同外源DNA片段的連接；3、對重組體的λDNA分子進行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體λ取代載體2、組裝連接3、侵染（三）凱倫噬菌體載體在λ噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，既有插入型又有替換型；在基因工程實驗中的用途十分廣泛承受外源DNA的能力：幾個kb到23kb（左右臂連接）（三段自身連接）（插入片段）三、λ噬菌體載體的改良改良的目標(biāo)：擴大克隆容量設(shè)計可對重組體分子作正選擇的克隆載體構(gòu)建可以方便的通過轉(zhuǎn)錄作用制備外源DNA插入序列之RNA探針的克隆載體發(fā)展可以使插入的真核cDNA與β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的克隆載體1、Spi-正選擇的λ噬菌體載體λ1059、λL47.1Spi-重組體的篩選野生型λ噬菌體不能在攜帶有P2原噬菌體的溶源菌中生長，λ的這種表型稱為Spi+(對P2的干擾敏感)但是當(dāng)λ基因組中缺少參與重組的兩個基因red和gam時，λ突變體可以在P2溶原菌中生長，其表型稱為Spi-?；騬ed和gam位于非必需區(qū)域內(nèi)，外源DNA片段能置換基因red和gam形成重組體，其重組體不能在recA-的P2溶源菌中繁殖可以在recA＋的P2溶源菌中繁殖并且顯示出Spi-的表型。因此只要選用recA+的P2溶源菌作為宿主菌，就可以對重組體進行篩選。recA＋的P2溶源菌λDNA的復(fù)制是由θ型向滾環(huán)型的轉(zhuǎn)變，受到gam基因控制基因gam功能：蛋白產(chǎn)物和寄主細胞的外切核酸酶Ⅴ（宿主recB和recC基因產(chǎn)物）結(jié)合成復(fù)合物，失去對λDNA的作用活性，因而λ噬菌體能夠合成成熟的多聯(lián)體DNA，供作包裝底物基因red功能：參與裂解性生長早期發(fā)生的重組反應(yīng)，是核酸外切酶，使θ型復(fù)制中的病毒DNA分離形成子代閉環(huán)DNA分子recA＋的P2溶原菌red-gam-：利用大腸桿菌的重組酶（recA＋），通過單體λDNA間的重組作用，產(chǎn)生出成熟的多聯(lián)體λDNA以進行包裝，大腸桿菌的重組系統(tǒng)依賴于recA基因。chi位點的引入

red和gam基因缺失(red-和gam-)的λ噬菌體在P2溶源菌或野生型大腸桿菌中生長較差，形成的噬斑很少，然而當(dāng)在λDNA中引人chi位點后，Spi-噬菌體在宿主菌中的繁殖力便會隨之增強，噬斑變大。chi位點（交換熱點激活區(qū)）由一段長度為八核苷酸的DNA序列組成，其序列為5’GCTGGTCG3’。野生型λDNA中并無此序列，但在大腸桿菌染色體DNA和真核基因組中都存在有chi序列，大腸桿菌DNA平均每5000bp出現(xiàn)一次chi序列。chi位點：與重組事件有關(guān)聯(lián)的DNA序列，激活以rec為媒介的交換反應(yīng)，是recB、C系統(tǒng)催化重組作用的底物。但RecB、C重組酶的活性可被基因gam的產(chǎn)物所抑制。因此對于red-、gam-突變體或因外源DNA的插入而呈Spi-表型的重組體而言，chi位點的引人會使噬菌體生長繁殖力變強，噬斑增大。四、體外包裝1、λ重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染作用λ噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然后以噬菌體感染（轉(zhuǎn)導(dǎo)）的方式將重組DNA導(dǎo)入E.coli細胞內(nèi)。因為以感染方式導(dǎo)入細胞的頻率可達106~108/μgDNA，而以轉(zhuǎn)染（translation）的方式導(dǎo)入的頻率僅為103~104/μgDNA。

體外包裝：把重組體DNA分子包裝成成熟的噬菌體顆粒，從而能夠按照正常的噬菌體感染過程導(dǎo)入宿主細胞，可以提高轉(zhuǎn)染效率，可達107左右。2、λ重組體DNA的體外包裝在A蛋白（有終止復(fù)制功能），E蛋白（是包裝蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重組體DNA轉(zhuǎn)入頭部。主要外殼蛋白是基因E的產(chǎn)物基因A的產(chǎn)物在cos位點切割后進入頭部包含在外殼中基因D的產(chǎn)物基因W和FⅡ的產(chǎn)物組裝成完整的尾部λ重組體DNA的體外包裝：在體外試管中完成上述反應(yīng)，利用D基因突變和E基因突變。E基因琥珀突變（Eam）不能形成任何頭部，積累大量的尾部D基因琥珀突變（Dam），λ重組體DNA不能進入頭部，成熟作用在頭部前體階段被終止，因而它感染的宿主中有大量頭部前體蛋白積累。使用具有cⅠ857突變基因的λ噬菌體的溶源大腸桿菌：BHB2690（Dam）和BHB2685（Eam）菌株培養(yǎng)獲得頭部和尾部cⅠ857是溫度敏感性阻遏基因，32℃為溶源狀態(tài)，44～45℃誘發(fā)，溶菌的S基因突變，因而不會溶菌。大量收集頭部尾部蛋白，在體外與重組λDNA包裝由于λ噬菌體包裝時，當(dāng)DNA的長度短于野生型的75%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48KB）的75%～105%左右的ＤＮＡ，要求λ載體DNA和外源DNA長度上限是51kb，必需基因為28kb，外源極限在23kb。3、λ噬菌體的包裝限制計算包裝范圍（KB）48×75%＝3648×105%＝51必需基因為28包裝范圍8kb～23kb《分子克隆試驗指南》78%～105%，包裝范圍在10～23kbλ噬菌體克隆載體是基因工程中一類很有價值的克隆載體，具有很多優(yōu)點：①其分子遺傳學(xué)背景十分清楚；②載體容量較大，一般質(zhì)粒載體只能容納10多個kb，而λ噬菌體載體卻能容納大約23kb的外源DNA片段；由于λ噬菌體頭部組裝時容納DNA的量是固定的，因此插入外源DNA長度必須控制在使重組DNA為野生型λDNA長度的75%~105%之間，否則難以正常組裝。③具有較高的感染效率，其感染宿主細胞的效率幾乎可達100%，而質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化率卻只0.1%。back第三節(jié)柯斯質(zhì)粒載體（Cosmidvector）1978年，J.collins和B.Hohn等人發(fā)展出的一種人工載體

帶有cos位點的質(zhì)粒載體

4-6kb，帶有選擇標(biāo)記，在構(gòu)建cDNA文庫中很有用。可攜帶大的外源DNA片段，克隆45kb基因。一、柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建

cosmid載體：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點、克隆位點、選擇性標(biāo)記λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細胞內(nèi)?？滤官|(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體λ的cos位點的一段DNA構(gòu)成全長4.3kb，克隆能力為31～45kb，能夠被包裝成具有感染性能的噬菌體二、柯斯質(zhì)粒載體的特點1、具有λ噬菌體的特性；插入合適長度外源基因后，可以在體外被包裝成噬菌體，可以高效的感染大腸桿菌，進入細胞后環(huán)化，并且不形成子代噬菌體2、具有質(zhì)粒載體的特性；含有質(zhì)粒復(fù)制子，進入寄主后可以象質(zhì)粒一樣復(fù)制，抗菌素抗性標(biāo)記可以進行篩選3、具有較高容量的克隆能力；分子量較小，一般4-6kb，因此插入的載體上并且可以被成功包裝的外源可以達到45kb最低極限，如果柯斯質(zhì)粒有5kb，外源必需要至少30kb4、具有與同源性序列的質(zhì)粒進行重組的能力在同一個宿主中的柯斯質(zhì)粒和質(zhì)粒會形成共合體。三、柯斯克隆柯斯克?。╟osmindcloning）：在大腸桿菌中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù)依據(jù)原理:λ噬菌體在生命周期可以產(chǎn)生數(shù)百個由cos位點連接的多連體分子末端酶（Ter體系）：能識別兩個相距適宜的cos位點，將多聯(lián)體切割成單位長度的片段，并包裝至頭部，作用有效范圍，兩個cos之間相距38～54kb。DigestionLigationC)PackagingandinfectFormationofacosmidclone四、柯斯克隆的改良優(yōu)點：1、兼具質(zhì)粒和噬菌體的特性，提高了克隆容量，對于構(gòu)建真核生物基因文庫十分有用；2、形成的非重組體克隆本底比較低采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難①載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個重組分子內(nèi)可有幾個柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結(jié)果的分析，后來專門選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時，每個載體只可能插入一個外源片段，因為如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；③細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費時間?，F(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。1、Ish－Horowicz－Burke柯斯克隆方案pJB8是由高拷貝的質(zhì)粒pAT153派生而來，能夠克隆大片段的外源DNA，適合于真核基因文庫構(gòu)建特點：在BamHⅠ兩端各有一個EcoRⅠcosBamHⅠHindⅢpJB8SalⅠHindⅢ、磷酸酶SalⅠ、磷酸酶cosOHOHSalⅠBamHⅠBamHⅠcosOHOHSalⅠppcosOHOHBamHⅠBamHⅠcosOHOHppHindⅢ真核基因組Sau3AI局部消化磷酸酶OHOH32～47kb2、Bates－Swift柯斯克隆方案c2XB具有兩個cos位點，一個BamH和SmaⅠ切點c2XB6.8kbcoscosBamHⅠSmaⅠSmaⅠBamHⅠcoscosSmaⅠ平末端BamHⅠBamHⅠSmaⅠ平末端真核基因組Sau3AI局部消化磷酸酶OHOH32～47kb3、其他柯斯克隆方案（1）在多克隆位點兩側(cè)引入T3和T7噬菌體的RNA聚合酶啟動子（圖5-23）（2）構(gòu)建與大腸桿菌質(zhì)粒沒有同源性序列的克斯載體，避免重組（3）導(dǎo)入真核生物的選擇性標(biāo)記，做為穿梭載體第四節(jié)單鏈DNA噬菌體載體單鏈DNA噬菌體載體M13、f1、fd優(yōu)越性：1、單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)制形式的DNA簡稱RFDNA；2、不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；3、單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多寡制約的，不存在包裝限制問題；4、容易測定外源DNA片斷的插入取向；5、可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。一、M13噬菌體生物學(xué)特性M13是一種含單鏈（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。這類載體主要用來獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學(xué)研究中主要用來測定ＤＮＡ序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。感染方式M13噬菌體是大腸桿菌特有的噬菌體，只能感染帶有F性須的菌株通過人工方式可以轉(zhuǎn)染雌性的大腸桿菌10個基因，90％以上都編碼蛋白質(zhì)僅有2個基因間隔區(qū)間隔區(qū)基因Ⅷ——噬菌體顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因Ⅲ——噬菌體顆粒的次要結(jié)構(gòu)蛋白基因Ⅱ——在RFDNA上形成切口

基因Ⅴ作用——單鏈DNA結(jié)合蛋白RFDNA復(fù)制方式：1、M13正鏈在基因Ⅲ編碼的蛋白作用下進入大腸桿菌細胞，合成出M13（－）鏈，雙鏈DNA為復(fù)制型（RFDNA）2、開始θ型復(fù)制3、進行θ復(fù)制后，在基因Ⅱ的作用下，在RFDNA正鏈的特定位點上作切割反應(yīng)4、利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，M13（－）為模板合成正鏈5、基因Ⅱ切割出完整的M13（＋）6、環(huán)化返回PhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolI±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.形態(tài)建成：

基因Ⅴ蛋白－DNA（正鏈）復(fù)合物移動至細菌的細胞膜的同時，基因Ⅴ蛋白脫落，病毒基因組從細菌溢出時被衣殼蛋白包裹二、M13噬菌體載體的寄主菌由于M13噬菌體通過F因子編碼的菌毛進入宿主細胞，故只能用雄性細菌來增殖病毒。lacZ△M15：缺失lacZ基因中β-半乳糖苷酶的N端部分編碼序列，很多宿主菌的F’附加體帶有這種缺失的lacZ基因。lacIq：lacI基因的突變體，可使lac操縱子阻遏物的合成量增加到野生型的10倍，很多宿主菌的F’附加體帶有這種lacIq和lacZ△M15基因。JM101：△（lac－proAB）

F’traD36

proAB＋

lacIqlacZ△M15proAB：細菌脯氨酸合成酶編碼區(qū)，proAB常出現(xiàn)在F’附加體上，可以彌補宿主的基因缺失，以確保F’在宿主體內(nèi)穩(wěn)定traD36：抑制F’接合轉(zhuǎn)移△（lac－proAB）：缺失乳糖操縱子及比鄰的脯氨酸生物合成酶類的編碼基因，這類寄主不能利用乳糖，生長必需脯氨酸1、M13載體系列的發(fā)展IGIG區(qū)段：位于基因Ⅱ和基因Ⅳ之間，長度507核苷酸

M13mpn：由M13mp1衍生而來三、M13克隆體系M13克隆載體分子結(jié)構(gòu)圖2、α互補作用M13載體：編碼β-半乳糖苷酶的N端，來源于β-半乳糖苷酶基因的HindⅡ酶切片段F’附加體：含有l(wèi)acZ△M15基因，缺失了編碼β-半乳糖苷酶中第11-41個氨基酸的lacZ基因，不能形成四聚體。藍白篩選3、對克隆基因的調(diào)節(jié)控制——lacIqlacI基因的突變體，可使lac操縱子阻遏物的合成量增加到野生型的10倍，合成大量的阻遏物阻止M13載體表達。加入誘導(dǎo)物IPTG，可以誘導(dǎo)合成Xgal顯色底物Blue-whiteselection返回四、M13載體系列的優(yōu)點1、在這類載體的基因組中有一條飾變的β-半乳糖苷酶基因片段（HindⅡ片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位點的序列；2、M13載體系列是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對地構(gòu)建的，可有效地克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。

具有多克隆位點(MCS)，方便克隆。許多M13載體的多克隆位點與質(zhì)粒載體pUC序列的多克隆位點是相同的，在克隆位點選擇上更為方便。返回3、可以定向地克隆DNA片段克隆在M13RFDNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。所以如果要同時分離ＤＮＡ分子中的雙鏈，則需要兩種獨立的克隆。根據(jù)M13的生物學(xué)特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（＋）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源ＤＮＡ克隆時的取向。這樣一來，為分別分離外源ＤＮＡ分子的兩條鏈帶來一定的麻煩，解決這一問題的一個行之有效的方法就是定向克隆技術(shù)。M13mp18MCSM13mp19MCSEcoRIBamHIHindIIIPstIBglIBglIPstIHindIIIBamHIEcoRI

BP

PBBP

BPPBBamHI&PstI噬菌體展示技術(shù)是將各種多肽或蛋白質(zhì)以融合蛋白的形式表達并展示在噬菌體表面，同時將其遺傳密碼包含于噬菌體內(nèi)部，這使得蛋白質(zhì)的功能與其基因密碼有機的連結(jié)在一起。

五、噬菌體展示技術(shù)非展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)（一）噬菌體展示技術(shù)的原理M13、fd顆粒的一端表面存在3～5拷貝的基因Ⅲ編碼的蛋白質(zhì)LeadM13基因III隨機多肽區(qū)LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表達型SolidphaseselectionwithimmunotubesBBBBBBvcoatedwithsteptavidinandbiotinylatedantigenBbiotin

antigenSolutionphaseselectionwithbiotinylatedantigenBindtoStreptavidincoatedmicrotitrewellsWashtoremoveunboundphageparticles.EluteboundphageAmplifyelutedphageRepeatselectionAnalyze a)ELISA b)Specificity c)Sequencing d)Affinity e)ActivityE.coli感染和擴增二、噬菌體抗體庫展示技術(shù)back第五節(jié)噬菌粒載體（phagemid）一、概念由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列。具有質(zhì)粒的復(fù)制起點、選擇性標(biāo)記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在；具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點，在輔助噬菌體幫助下，可進行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。噬菌粒的特點比M13小，約為3000bp，易于體外操作，可以克隆10kb外源兩種復(fù)制方式