第7章蛋白質分離純化

蛋白質的分離純化與表征蛋白質的酸堿性質蛋白質分子的大小與形狀蛋白質膠體與沉淀蛋白質分離純化的一般原則蛋白質分離純化的方法蛋白質含量測定與純度鑒定第七章蛋白質的分離純化與表征現在是1頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質的酸堿性質蛋白質中可解離的基團蛋白質的等電點1－蛋白質的酸堿性質現在是2頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質中可解離的基團-NH3+pKa=7.6~8.4-COO-pKa=3~3.2NextPage1－蛋白質的酸堿性質現在是3頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質中可解離的基團-COO-pKa=3.0~4.7-COO-pKa=4.41－蛋白質的酸堿性質現在是4頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質中可解離的基團pKa=5.6~7.0-NH2pKa=9.4~10.61－蛋白質的酸堿性質現在是5頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質中可解離的基團pKa=11.6~12.6pKa=9.8~10.4pKa=9.1~10.81－蛋白質的酸堿性質現在是6頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質的等電點蛋白質等電點蛋白質等電點胃蛋白酶1.0-胰凝乳蛋白酶8.3卵清蛋白4.6-胰凝乳蛋白酶原9.1血清清蛋白4.7核糖核酸酶9.5-乳球蛋白5.2細胞色素C10.7胰島素5.3溶菌酶11.0血紅蛋白6.71－蛋白質的酸堿性質現在是7頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質分子的大小與形狀根據化學組成測相對分子量滲透壓法測相對分子量擴散系數法測相對分子量沉降分析法測相對分子量凝膠過濾法測相對分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量2－蛋白質的分子形狀與大小現在是8頁\一共有65頁\編輯于星期四根據化學組成測相對分子量肌紅蛋白（Mb）M.W.=(Fe原子量)/(Mb中Fe含量)*100=55.8/0.335*100=16700血紅蛋白（Hb）一分子中含有4個Fe原子，因此：MW=4*16700=668002－蛋白質的分子形狀與大小現在是9頁\一共有65頁\編輯于星期四滲透壓法測相對分子量=RT(+K*c2)cMrc=RTMr+K*cc~cMr=RTlimc0cMr=10000~1000002－蛋白質的分子形狀與大小現在是10頁\一共有65頁\編輯于星期四擴散系數法測相對分子量Fick第一擴散定律：擴散系數D求法（Fick第二擴散定律）dmdt=-D*A*dcdxdcdt=-Dd2cdx2c2c1=exp(-)x22-x124Dt2－蛋白質的分子形狀與大小現在是11頁\一共有65頁\編輯于星期四擴散系數法測相對分子量擴散系數D隨蛋白質Mr的增加而降低。蛋白質Mr擴散系數（107cm2s-1)核糖核酸酶A1260011.9細胞色素c1337011.4肌紅蛋白1690011.3凝乳蛋白酶原232409.5血紅蛋白645006.9過氧化氫酶2475004.1肌球蛋白5248001.12－蛋白質的分子形狀與大小現在是12頁\一共有65頁\編輯于星期四沉降分析法測相對分子量蛋白質分子在溶液中受到強大的離心力作用時，如果蛋白質的密度大于溶液的密度，蛋白質分子就會沉降。沉降速率與蛋白質分子的大小和密度有關，而且與分子形狀、溶液的密度和粘度有關。2－蛋白質的分子形狀與大小現在是13頁\一共有65頁\編輯于星期四沉降分析法測相對分子量斯維得貝格方程：Mr=RTsD(1-)s為沉降系數:單位秒-1，通常將10-13秒作為一個單位用S表示為偏微比容：蛋白質溶于水為0.74cm3/g為溶劑的密度2－蛋白質的分子形狀與大小現在是14頁\一共有65頁\編輯于星期四2－蛋白質的分子形狀與大小現在是15頁\一共有65頁\編輯于星期四凝膠過濾法測相對分子量洗脫液體積（mL）蛋白質含量相對分子量MrABCD待測蛋白分子量2－蛋白質的分子形狀與大小現在是16頁\一共有65頁\編輯于星期四SDS-聚丙烯酰胺

凝膠電泳法測相對分子量電泳時的遷移率取決于蛋白的凈電荷、分子大小、形狀；SDS（十二烷基硫酸鈉）與蛋白質結合，使全部呈負電荷，同時改變蛋白質單體分子構象成近似球形；巰基乙醇打開二硫鍵，使亞基分離；電泳時蛋白質向正極移動。分連續(xù)和不連續(xù)體系（圓盤電泳）2－蛋白質的分子形狀與大小現在是17頁\一共有65頁\編輯于星期四SDS-聚丙烯酰胺

凝膠電泳法測相對分子量2－蛋白質的分子形狀與大小現在是18頁\一共有65頁\編輯于星期四SDS-聚丙烯酰胺

凝膠電泳法測相對分子量ABRf=A/B2－蛋白質的分子形狀與大小現在是19頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質膠體性質膠體穩(wěn)定性的三個要素：質點大小1~100nm；帶相同電荷；形成溶劑化層；穩(wěn)定親水性蛋白質膠體的因素：水化層：雙電層：3－蛋白質的膠體性質現在是20頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質的沉淀鹽析法：NaCl、(NH4)2SO4有機溶劑沉淀：乙醇、丙酮重金屬鹽沉淀：Hg2+、Ag+生物堿與某些酸類沉淀：單寧酸、TCA加熱變性沉淀：3－蛋白質的膠體性質現在是21頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質分離純化的一般原則總目標：增加蛋白質含量與生物活性，除去不必要的雜質蛋白；前處理：細胞破碎粗分級分離：鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等細分級分離：層析、電泳、結晶4－蛋白質的分離純化現在是22頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質的分離純化方法根據下列性質將蛋白分離純化： 分子大小 溶解度 電荷 吸附性質 對配體分子的親和力4－蛋白質的分離純化現在是23頁\一共有65頁\編輯于星期四透析與超過濾4－蛋白質的分離純化現在是24頁\一共有65頁\編輯于星期四透析通常是將濃縮液裝在一個用賽咯吩（cellophane）制造的透析袋內，兩端都密封好，然后將透析袋懸浮在一個裝有很多緩沖液的容器內進行透析。因為賽咯吩膜是半通透的膜，蛋白質等大分子不能透過膜，仍然留在袋內，但蛋白質周圍的小分子可以與緩沖液進行交換，通過多次更換透析液，就可除去小分子（如硫酸銨）。經硫酸銨分級純化、透析的粗分級的蛋白質樣品可以通過以下一些常用的分離純化技術和方法進一步純化和鑒定。4－蛋白質的分離純化現在是25頁\一共有65頁\編輯于星期四現在是26頁\一共有65頁\編輯于星期四超濾超濾是一種膜分離技術，它的特點是使用不對稱多孔膜，根據分子的大小來分離溶液中的大分子物質與小分子物質。超濾尤其適用于大分子溶液的濃縮，不同種類分子的純化以及溶劑交換等。超濾法是一種溫和的、非變性的物理分離方法。4－蛋白質的分離純化現在是27頁\一共有65頁\編輯于星期四超濾離心管切向流超濾器4－蛋白質的分離純化現在是28頁\一共有65頁\編輯于星期四離心技術離心技術主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質量、大小和密度。密度梯度離心技術是利用每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的密度梯度時即停止不前，最后各種蛋白質在離心管中被分離成各自的區(qū)帶。常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。4－蛋白質的分離純化現在是29頁\一共有65頁\編輯于星期四差

速

離

心Differentialcentrifugationasafirststepinproteinpurification4－蛋白質的分離純化現在是30頁\一共有65頁\編輯于星期四密度梯度（區(qū)帶）離心4－蛋白質的分離純化現在是31頁\一共有65頁\編輯于星期四密度梯度（區(qū)帶）離心4－蛋白質的分離純化現在是32頁\一共有65頁\編輯于星期四凝膠過濾

凝膠過濾層析是依據分子大小這一物理性質進行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內部具有立體網狀結構，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。4－蛋白質的分離純化現在是33頁\一共有65頁\編輯于星期四凝膠過濾（分子排阻層析）基于分子大小4－蛋白質的分離純化現在是34頁\一共有65頁\編輯于星期四利用溶解度差別的純化等電點沉淀（等電點時靜電荷為零，相鄰蛋白質分子間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀）鹽析與鹽溶（中性鹽可以增加蛋白質的溶解度，稱為鹽溶；鹽析作用主要是大量中性鹽爭奪蛋白質疏水表面水分子）有機溶劑分級分離（有機溶劑降低蛋白質表面可解離基團的離子化程度，促進蛋白質的聚集和沉淀）4－蛋白質的分離純化現在是35頁\一共有65頁\編輯于星期四利用溶解度差別的純化分級沉淀（鹽或有機溶劑）4－蛋白質的分離純化現在是36頁\一共有65頁\編輯于星期四利用電荷差別的純化聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦離子交換層析層析聚焦4－蛋白質的分離純化現在是37頁\一共有65頁\編輯于星期四聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）平板電泳4－蛋白質的分離純化現在是38頁\一共有65頁\編輯于星期四聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）管狀電泳圖譜平板PAGE圖譜4－蛋白質的分離純化現在是39頁\一共有65頁\編輯于星期四等電聚焦電泳蛋白質是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。在電場存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負極移動而帶負電的蛋白分子將向正極移動，在某一pH時，蛋白分子在電場中不再移動，此時的pH值即為該蛋白質的等電點。等電聚焦(IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質從而構成從正極到負極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。4－蛋白質的分離純化現在是40頁\一共有65頁\編輯于星期四等電聚焦電泳蛋白質在具有pH梯度的介質中電泳4－蛋白質的分離純化現在是41頁\一共有65頁\編輯于星期四等電聚焦電泳4－蛋白質的分離純化現在是42頁\一共有65頁\編輯于星期四二維電泳1975年，O’Farrell首先運用雙向電泳技術將大腸桿菌總蛋白分離出1100多個蛋白點。后來此技術一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前，隨著蛋白組工程的發(fā)展，雙向電泳技術越來越廣泛的用于發(fā)現未知蛋白。二維電泳由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)組成，第一向使等電點不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結合便得到高分辨率的蛋白圖譜。4－蛋白質的分離純化現在是43頁\一共有65頁\編輯于星期四二維電泳IsoelectricfocusingisoftencombinedwithSDStogeneratetwodimensionalgels.4－蛋白質的分離純化現在是44頁\一共有65頁\編輯于星期四二維電泳的應用示例4－蛋白質的分離純化現在是45頁\一共有65頁\編輯于星期四離子交換層析陽離子交換劑：CM-纖維素：-O-CH2COOHP-纖維素：磷酸基陰離子交換劑：DEAE-纖維素：二乙基氨基乙基AE-纖維素：氨基乙基4－蛋白質的分離純化現在是46頁\一共有65頁\編輯于星期四離子交換層析4－蛋白質的分離純化現在是47頁\一共有65頁\編輯于星期四4－蛋白質的分離純化現在是48頁\一共有65頁\編輯于星期四親和層析原理：依賴于蛋白質和它的配體（ligand）之間的相互作用來分離。配體通常指的是能與另一個分子或原子結合（一般是非共價結合）的分子、基團、離子或原子。但在親和層析中，配體是通過共價鍵先與基質結合。配體可以是酶結合的一個反應物或產物，或是一種可以識別靶蛋白的抗體，也可以是受體、核酸、細胞器等。親和層析是分離效率最高的分離方法。4－蛋白質的分離純化現在是49頁\一共有65頁\編輯于星期四親和層析過程示意圖（1）4－蛋白質的分離純化現在是50頁\一共有65頁\編輯于星期四親和層析過程示意圖（2）4－蛋白質的分離純化現在是51頁\一共有65頁\編輯于星期四親和層析過程示意圖（3）4－蛋白質的分離純化現在是52頁\一共有65頁\編輯于星期四親和層析過程示意圖（4）4－蛋白質的分離純化現在是53頁\一共有65頁\編輯于星期四4－蛋白質的分離純化現在是54頁\一共有65頁\編輯于星期四高效液相層析（HPLC）高效液相色譜（HPLC：HighPerformanceLiquidChromatography）與普通的色譜技術不同的是：填料密度高，洗脫液壓力加大，分離效果更好。是化學、生物化學與分子生物學、醫(yī)藥學、農業(yè)、環(huán)保、商檢、藥檢、法檢等學科領域與專業(yè)最為重要的分離分析技術，是分析化學家、生物化學家等用以解決他們面臨的各種實際分離分析課題必不可缺少的工具。國際市場調查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。4－蛋白質的分離純化現在是55頁\一共有65頁\編輯于星期四高效液相層析（HPLC）高效液相色譜的優(yōu)點是：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復性好，定量精度高，應用范圍廣。適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。其缺點是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多。目前的發(fā)展趨勢是向生物化學和藥物分析及制備型傾斜。4－蛋白質的分離純化現在是56頁\一共有65頁\編輯于星期四4－蛋白質的分離純化現在是57頁\一共有65頁\編輯于星期四高效液相層析（HPLC）HighPressureLiquidChromatographyHighpressurelimitsdiffusionandincreasesinteractionswithchromatographymediaHPLCgivesveryhighresolutionofproteincomponents4－蛋白質的分離純化現在是58頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質純化過程實例4－蛋白質的分離純化現在是59頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質的含量測定凱氏定氮法雙縮脲法Folin-酚法（Lowry法，蛋白質在堿性溶液中與銅形成復合物，此復合物及芳香族氨基酸還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑產生藍色。）紫外吸收法Bradford法（考馬斯亮藍染料結合法）BCA法（bisinchoninicacidmethod）5－蛋白質的含量測定現在是60頁\一共有65頁\編輯于星期四蛋白質的純度鑒定電泳（等電聚焦、SDS、PAGE）沉降法HPLC溶解度分析N－末端分析6－蛋白質的純度鑒定