臨床分子生物學(xué)檢驗

緒論1.20世紀50年代，Waston和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，標志著現(xiàn)代分子生物學(xué)的興起。從廣義上來講，應(yīng)用到臨床的分子標志物包括基因組DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)和各種代謝物，目前，臨床分子生物學(xué)檢驗的靶標主要以核酸（DNA或RNA）為主。第一章：核酸與分子標志物1.分子標志物：可以反映機體生理、病理狀態(tài)的核酸、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等生物分子，是生物標志物的一種類型。核酸分子標志物是分子生物學(xué)檢驗的主要內(nèi)容，包括基因突變、DNA多態(tài)性、基因組DNA片段、RNA和循環(huán)核酸等多種形式。2.DNA的組成：是一種高分子化合物，其基本單位是脫氧核苷酸，每個核苷酸由磷酸、脫氧核糖和含氮堿基3部分組成。3.DNA與RNA的區(qū)別：2位脫氫。4.DNA的結(jié)構(gòu)：①DNA一級結(jié)構(gòu)：各種核苷酸單體沿多核苷酸鏈排列的順序，表明該DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。②DNA二級結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu)，DNA雙螺旋的直徑為2nm,一圈螺旋含10個堿基對，每一圈螺距為3.4nm，每個堿基的旋轉(zhuǎn)角度為36度。維持DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的力量主要是堿基對之間的堆積力，堿基對之間的氫鍵也起著重要的作用。③DNA三級結(jié)構(gòu)：DNA雙螺旋進一步盤曲形成的更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。核小體的形成（真核生物染色體包裝過程）：在核小體中,DNA盤繞組蛋白八聚體核心,使DNA縮短為原來的1/7；6個核小體形成螺絲管，縮短為1/6；核小體彼此相連成串珠狀染色質(zhì)細絲，螺旋化形成染色質(zhì)纖維，進一步折疊成染色單體。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的變異：右手螺旋A-DNA、C-DNA、D-DNA、E-DNA、H-DNA、L-DNA、P-DNA，左手螺旋Z-DNARNA主要分為三類:tRNA、rRNA、mRNA還有一些小型RNA：反義RNA、微小RNA（microRNA,miRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA。）真核mRNA與原核mRNA的區(qū)別（簡答題）原核mRNA結(jié)構(gòu)簡單，為多順反子，編碼序列之間有間隔序列，原核生物mRNA中沒有修飾堿基。真核生物mRNA為單順反子結(jié)構(gòu)，成熟的mRNA中5’端有帽子結(jié)構(gòu)，3’端有polyA尾巴。原核生物主要的rRNA（占細胞總RNA80%）有三種：5S、16S、23S；真核生物有四種5S、5.8S、18S和28SrRNA基因：能編碼有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或合成RNA所必需的全部核酸序列，是核酸分子的功能單位。順式調(diào)節(jié)：一個基因的調(diào)控區(qū)和結(jié)構(gòu)基因位于同一DNA分子的相鄰部位，其作用是參與基因表達的調(diào)控。啟動子：一段位于結(jié)構(gòu)基因5’端的上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。操縱序列（操縱元件）可被具有抑制轉(zhuǎn)錄作用的阻遏蛋白識別并結(jié)合12.真核生物基因結(jié)構(gòu)包括外顯子和內(nèi)含子，稱為斷裂基因13.增強子：可位于基因的上游或下游，也可位于內(nèi)含子中，它不能啟動一個基因的轉(zhuǎn)錄，但有增強轉(zhuǎn)錄的作用14:表觀遺傳：在DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因功能出現(xiàn)可逆的、可遺傳的變化。包括組蛋白修飾（包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化、糖基化）、DNA甲基化、RNA干擾等。DNA甲基化：生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過程。DNA甲基化一般發(fā)生在CG雙核苷酸的C上面。16.基因突變類型：點突變、插入缺失、動態(tài)突變17.錯義突變：點突變改變了三聯(lián)體密碼子，導(dǎo)致基因產(chǎn)物中某個氨基酸被另一個氨基酸所取代。18.無義突變（鏈終止突變）：DNA序列的改變使得編碼某一氨基酸的密碼子突變終止密碼，則導(dǎo)致翻譯過程提前終止。19.基因組：一個細胞或一種生物體的整套遺傳物質(zhì)，包括基因和非編碼DNA20.原核生物基因組特征：基因組較小沒有典型的細胞核結(jié)構(gòu)操縱子結(jié)構(gòu)是原核生物基因組的功能單位原核生物的結(jié)構(gòu)基因中無內(nèi)含子成分，不需要經(jīng)過剪接加工過程具有編碼同工酶的基因含有可移動DNA序列質(zhì)粒：指細菌細胞染色體以外，能獨立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的共價閉合環(huán)狀分子。轉(zhuǎn)座因子（轉(zhuǎn)座元件）：是一類在細菌染色體、質(zhì)粒或噬菌體之間自行移動并具有轉(zhuǎn)位特性的獨立的DNA序列。包括插入序列、轉(zhuǎn)座子、Mu噬菌體病毒基因組類型：人類基因組包括：細胞核內(nèi)的核基因組和細胞質(zhì)內(nèi)的線粒體基因組。人類基因組的最大特征：存在大量的非編碼序列和重復(fù)序列多基因家族：由某一祖先基因經(jīng)過重復(fù)和變異所產(chǎn)生的一組基因。假基因：在多基因家族中，某些成員并不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這些基因稱為假基因。多態(tài)性：不同的個體之間，在基因組DNA序列上會存在差異，平均而言，一對同源染色體每1000個堿基就會出現(xiàn)一個堿基的差異(基因組中蛋白質(zhì)編碼區(qū)大概是每2500個堿基出現(xiàn)一個差異)。當某種變異相對常見，在群體中的頻率高于1%時，則成為多態(tài)性。人類基因組多態(tài)性形式：限制性片段長度多態(tài)性小衛(wèi)星和微衛(wèi)星多態(tài)性單核苷酸多態(tài)性拷貝數(shù)多態(tài)性30.單核苷酸多態(tài)性：在基因組水平上由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性：核酸雜交技術(shù)核酸分子雜交：單鏈的核酸分子在合適的條件下，與具有堿基互補序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過程。核酸分子雜交的基本原理：在一定條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，DNA分子成為單鏈；將一種核酸單鏈標記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行堿基互補配對，變性DNA只要消除變性條件，有堿基互補區(qū)域的單鏈又可以重新結(jié)合成雙鏈，形成異源核酸分子的雙鏈結(jié)構(gòu)。復(fù)性：變性DNA只要消除變性條件，有堿基互補區(qū)域的單鏈又可以重新結(jié)合成雙鏈，這一過程稱作復(fù)性。碼逆轉(zhuǎn)錄蛋白）、env基因（編碼包膜前體蛋白）6個調(diào)控基因：tat、rev、nef、vif、vpr、vpu/vpx等。流感病毒的遺傳物質(zhì)：單股負鏈RNA人流感病毒分為甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，流感病毒的遺傳物質(zhì)是單股負鏈RNA：單基因遺傳病的分子生物學(xué)檢驗人類的單基因遺傳病的主要遺傳方式分為三種：常染色體遺傳、X連鎖遺傳、Y連鎖遺傳。單基因遺傳病分子生物學(xué)檢驗的策略包括直接和間接診斷策略直接診斷策略：直接揭示導(dǎo)致遺傳病發(fā)生的各種遺傳缺陷，即用分子生物學(xué)技術(shù)直接檢出致病基因的突變或由于結(jié)構(gòu)變化與轉(zhuǎn)錄異常導(dǎo)致的基因的表達量的改變等遺傳缺陷。鐮狀細胞貧血發(fā)生的分子機制：鐮狀細胞貧血患者由于β珠蛋白基因中第6位密碼子存在單個堿基的突變，由原來的GAG變成GTG，使谷氨酸變成纈氨酸，導(dǎo)致氧結(jié)合能力過低，紅細胞發(fā)生鐮變。：腫瘤分子生物學(xué)檢驗?zāi)[瘤相關(guān)的基因：原癌基因、腫瘤抑癌基因、細胞周期調(diào)節(jié)基因、細胞凋亡基因、維持細胞基因組穩(wěn)定基因、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因、腫瘤血管生成相關(guān)基因原癌基因：人類固有的一類基因，能誘導(dǎo)細胞正常轉(zhuǎn)化并使之獲得新生物特征的基因總稱。原癌基因激活機制包括：插入激活、基因重排（染色體異位）、基因點突變（移碼突變）、基因擴增、基因轉(zhuǎn)錄改變抑癌基因：可編碼對腫瘤形成起阻抑作用蛋白質(zhì)的基因，正常情況下負責控制細胞的生長和增殖。血液基因組提取苯酚/氯仿作用：對蛋白質(zhì)有極強的變性作用，而對DNA卻沒有影響，經(jīng)苯酚/氯仿抽提后，苯酚/氯仿層與水相完全分層，蛋白質(zhì)變性而被離心沉淀降到苯酚/氯仿相和水相的界面，DNA則留在水相。標本中的脂類雜質(zhì)溶解于苯酚/氯仿，從而與水相分離得以去除。異丙醇：沉淀RNA加入苯酚/氯仿后離心，分為三層分別是：水、變性的蛋白質(zhì)、有機溶劑（氯仿）。電泳結(jié)果分析：動物組織總RNA的提取及鑒定電泳A．結(jié)果分析：B.電泳方向：負極泳動到正極（RNA帶負電）。C.電泳中分子量大跑的慢D.上樣緩沖液LoadingBuffer成分：蔗糖（增加樣品質(zhì)量）、溴酚藍（指示電泳過程）溴化乙錠EB作用：結(jié)合核酸，紫外光下變紅注意事項：a.為防止RNA酶污染，要對試劑RNA酶處理，戴手套b.若RNA降解，重新提取OD260nm=1時DNA=50ng