離子交換層析柱的裝填及處理

離子交換層析柱的裝填及處理一、 原理：有些高分子物質(zhì)含有一些可以分離的基因，例如-SO3H,-COOH等，因此可以和溶液中的離子產(chǎn)生交換反應(yīng)。如：R-SO3H+M+R-S3M+H+或R-NH3OH+CL R-NH3CL+OH一這類高分子物質(zhì)通稱離子交換劑，其中使用最普遍的是離子交換樹脂。由于一定的離子交換劑對不同離子的親和力不同，因此在洗提過程中，不同的離子在離子交換柱上的遷移速度也不同，最后得到分離。二、 目的與要求：本實驗是采用Zerolit225型陽離子交換樹脂所裝的柱，選以特定的PH緩沖洗脫液來分離含有兩個性質(zhì)不同的氨基酸溶液。通過實驗要求掌握裝柱、上樣、洗脫、收集等離子交換柱層析技術(shù)的要點。三、 儀器與裝置：玻璃層析柱：長19cm，內(nèi)徑1、2cm，3#砂芯。HL-2型恒流泵。HD-4型電腦核酸蛋白檢測儀。BS-100A自動部份收集器。250ml燒杯。1ml吸管。水浴鍋。72型（或721型）分光光度計。四、 試劑與藥品：樹脂：Zerolit225型陽離子交換樹脂。洗脫液：0、45N，PH5、3檸檬酸緩沖液，取285g檸檬酸(C6O7H8H2O)；186g97%NaOH；105ml濃硫酸溶于水中稀釋至10升。樣品液：0、005MASP和LYs的0、02NHCL混合溶液。顯色劑：顯色劑列出兩種可任選一種。顯色劑(I)茚三酮-TiCL3溶液。10g茚三酮溶于500m1乙二醇甲醚，再加入0、85mlTiCL3(15%)顯色劑(II)：茚三酮-KCN溶液。0、1MKCN：0、1628gKCN溶于水中稀釋至250mlA、將1、25g茚三酮溶于25ml乙二醇甲醚，配成5%(W/V)濃度的溶液。B、將2、5ml0、01MKCN溶液與125ml乙醇甲醚混合。將A和B合并置棕色瓶中過夜即可使用。此溶劑用時，A、B兩溶液在前一天合并，配好的溶液僅能在1-2天內(nèi)使用，過時失效須重配。五、 方法與步驟：1、 樹脂的處理：關(guān)于市售新樹脂的處理見7、，本實驗采用處理好的樹脂。2、 裝柱：將層析柱垂直裝好，關(guān)閉柱底出口，在柱內(nèi)注入約1cm高的檸檬酸緩沖液。將經(jīng)處理已成鈉型的樹脂置于燒杯中，加進1倍體積的檸檬酸緩沖液，攪成懸浮狀沿柱內(nèi)壁細(xì)心、地把柱灌滿。倒時不要太快，以免產(chǎn)生泡沫。待樹脂在柱底逐漸沉積至約1cm高時，用吸管吸去柱內(nèi)上層所出現(xiàn)的清液，慢慢打開柱底出口，繼續(xù)加注樹脂懸液直至柱體裝到8cm高度為止。在裝柱時要避免使柱內(nèi)液體流干而使裝柱失敗，另外樹脂懸浮液的溫度要相對恒定（特別是對于采用高溫法）。裝好的柱體應(yīng)該沒有紋路，沒有節(jié)痕，沒有氣泡，柱頂表面平整而均勻。如此，方可投入使用，否則須要重裝。3、 平衡:柱裝好后接上調(diào)好流速的恒流泵或恒壓洗脫瓶，用檸檬酸緩沖洗脫液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的PH與洗脫液的PH相同為止，這大約需要2-3倍床體積。4、 加樣與洗脫：移去柱上加液器塞，打開柱底出口，小心、使柱內(nèi)液體流至體表面時即行關(guān)閉。用加樣吸管吸取0、5ml氨基酸酸混合樣品溶液。沿柱壁小心、地加入柱中，加樣不要過快，以免沖壞樹脂表面，加樣后慢慢打開柱底閥，使液面再與樹脂面相齊時關(guān)閉，然后再用吸管吸取適量洗脫液，如此清洗柱內(nèi)壁四周2-3次。洗滌后，用緩沖液在柱內(nèi)加至2-3cm高的液層，然后接上加液器，調(diào)好流速（24ml/hr）即開始洗脫。注意在調(diào)節(jié)流速時要排除掉恒流泵或恒壓瓶與柱之間連接管內(nèi)的所有氣泡。并且在調(diào)節(jié)時不要過猛，以免影響層析行為。5、 收集：柱流液可用自部分收集器約收20管。6、 測定:將收集的各管編號后，分別取0、5ml收集液于一潔凈的干試管中，加入1m］洗脫緩沖液；0、5mlKCN茚三酮試劑，混合后在100笆水浴加熱25分鐘，然后水冷卻5-10分鐘，加3ml60%乙醇稀釋，搖勻后用72型或721型分光光度計在570nm處比色。測定后，以光吸收為縱坐標(biāo)，收集的管數(shù)或ml數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。7、 再生:對于裝好的柱使用幾次后需要0、2NNaOH溶液洗脫，再用蒸餾水洗至中性后重復(fù)使用。對于市售的干樹脂其處理方法為：先經(jīng)水充分溶張后，傾泌去除細(xì)粒并使水澄清。然后經(jīng)浮選得到顆粒大小合適的樹脂，浮先后用4倍量的2NHCL和2NNaOH依次浸洗，每次半小時，換酸或堿時要用水將樹脂洗至中性，最后樹脂應(yīng)處理至溶液無黃色。這時再用1NNaOH使樹脂轉(zhuǎn)成鈉型（對于基它的轉(zhuǎn)型要視實驗和樹脂的情形而定），以蒸餾水洗至中性備用。對于不知或難以估計層析行為的樣品層析時，要采用逐管收