基因編輯技術(shù)的概念和原理

基因編輯技術(shù)的概念和原理第1頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯技術(shù)的概念和原理第2頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四什么是基因編輯技術(shù)？基因編輯是指對基因組進(jìn)行定點修飾的一項新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點上，在這位點上剪斷靶標(biāo)DNA片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變，又修改并編輯了原有的基因組，真正達(dá)成了“編輯基因”。第3頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯的研究背景傳統(tǒng)的動物育種方法受到種源的限制，其程需要耗費大量的人力、物力和財力，經(jīng)歷漫長的培育過程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進(jìn)展。

第4頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯的研究背景現(xiàn)代動物分子育種中，分子標(biāo)記技術(shù)能夠定位與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，鎖定基因與性狀的對應(yīng)關(guān)系，從而快捷可靠地對動物后代進(jìn)行篩選。但是，利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助篩選，改良的程度依然受限于品種自身已有的基因。所以，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行品種改良，可以突破種源的限制及種間雜交的瓶頸，獲取新品種，因此分子育種更為本質(zhì)和直接。第5頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯的研究背景目前，獲得突變體的常見方法是利用T-DNA或轉(zhuǎn)座子構(gòu)建大規(guī)模的隨機(jī)插入突變體庫，但是構(gòu)建覆蓋全基因組的飽和突變體庫需要的工作量大且耗費的時間長。而通過定點突變的方法使目的基因完全失活，是一種最直接有效的研究特定基因功能的方法。第6頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯的研究背景近年來，隨著高特異性及更具操作性的人工核酸酶的出現(xiàn)和技術(shù)體系的完善，基因組編輯技術(shù)獲得了飛速發(fā)展，并將靶向基因操作推向高潮，使得定點基因敲除、敲入變得更為簡單且高效。第7頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯的優(yōu)勢與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)保留了可定點修飾的特點，可應(yīng)用到更多的物種上，效率更高，構(gòu)建時間更短，成本更低。第8頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯原理現(xiàn)代基因組編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即借助特異性DNA雙鏈斷裂(DNAdouble-strandbreaksDSBs)激活細(xì)胞天然的修復(fù)機(jī)制，包括非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(fù)(HDR)兩條途徑。第9頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯原理非同源末端連接（NHEJ）是一種低保真度的修復(fù)過程，斷裂的DNA修復(fù)重連的過程中會發(fā)生堿基隨機(jī)的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實現(xiàn)目的基因敲除。如果一個外源性供體基因序列存在，NHEJ機(jī)制會將其連入雙鏈斷裂DSB位點，從而實現(xiàn)定點的基因敲入。第10頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯原理同源重組修復(fù)（HR）

是一種相對高保真度的修復(fù)過程，在一個帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整的整合到靶位點，不會出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或丟失。如果在一個基因兩側(cè)同時產(chǎn)生DSB，在一個同源供體存在的情況下，可以進(jìn)行原基因的替換。第11頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯原理第12頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯技術(shù)的種類目前主要有3種基因編輯技術(shù)，分別為：人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(zinc-fingernucleases，ZFN)技術(shù)；轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)技術(shù)；RNA引導(dǎo)的CRISPR-Cas核酸酶技術(shù)(CRISPR-CasRGNs)。第13頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四1.ZFN基因組編輯技術(shù)ZFN技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能的實現(xiàn)是基于具有獨特的DNA序列識別的鋅指蛋白發(fā)展起來的。1986年Diakun等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族的DNA結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2-His2鋅指模塊，到1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對由4個鋅指連接而成的ZFN可識別24bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用。第14頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四ZFN由鋅指蛋白(ZFP)和FokⅠ核酸內(nèi)切酶組成。其中，由ZFP構(gòu)成的DNA識別域能識別特異位點并與之結(jié)合，而由FokⅠ構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點的雙鏈DNA斷裂(DSB)。于是，細(xì)胞可以通過同源重組(HR)修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來修復(fù)DNA。HR修復(fù)有可能會對靶標(biāo)位點進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而NHEJ修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達(dá)到基因敲除的目的。第15頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四ZFN誘導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但是目前?個方面的缺陷制約了該技術(shù)的推廣:(1)以現(xiàn)有的策略設(shè)計高親和性的ZFN，需要投入大量的工作和時間;(2)在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)ZFN對細(xì)胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設(shè)計具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應(yīng)。第16頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四2.TALEN基因組編輯技術(shù)2009年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子，它的蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有較恒定的對應(yīng)關(guān)系。隨后，TALE特異識別DNA序列的特性被用來取代ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它可設(shè)計性更強，不受上下游序列影響，具備比ZFN更廣闊的應(yīng)用潛力。第17頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四TALENs包含兩個TALEN蛋白,每個TALEN都是由TALEarray與FokⅠ融合而成.其中一個TALEN靶向正義鏈上靶標(biāo)位點,另一個則靶向反義鏈上的靶標(biāo)位點.然后FokⅠ形成二聚體,在靶向序列中間的spacer處切割DNA,造成雙鏈DNA斷裂,隨后細(xì)胞啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制.針對不同的TALEN骨架,其最適宜的spacer長度不同,其長度范圍一般為12~20bp.實驗結(jié)果表明,TALENs在靶向DNA時,第一個堿基為T時其結(jié)合效果更佳。第18頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四目前，TALEN已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、哺乳動物和植物的位點特異性基因打靶，與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應(yīng)用優(yōu)勢，但仍然有些問題需要解決，例如:脫靶效應(yīng)、TALEN與基因組進(jìn)行特異結(jié)合與染色體位置及鄰近序列有關(guān)等。第19頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四3.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)1987年，Ishino等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。經(jīng)過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細(xì)菌獲得性免疫的關(guān)系。第20頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四在這個系統(tǒng)中，只憑借一段RNA便能識別外來基因并將其降解的功能蛋白引起了研究者的興趣。直到2012年，Jinek等第一次在體外系統(tǒng)中CRISPR/Cas9為一種可編輯的短RNA介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，標(biāo)志著CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)成功問世。3.CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)第21頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四CRISPR/Cas系統(tǒng)由Cas9核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成.轉(zhuǎn)錄的sgRNA折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與Cas9蛋白形成復(fù)合體,指導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶識別特定靶標(biāo)位點,在PAM序列上游處切割DNA造成雙鏈DNA斷裂,并啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制.從不同菌種中分離的CRISPR/Cas系統(tǒng),其CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列的長度不同,PAM序列也可能不同。第22頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四三種不同技術(shù)的比較第23頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四續(xù)表第24頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯新技術(shù)的用途基因功能研究基因治療構(gòu)建模式動物改造和培育新品種第25頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四1.基因功能研究基因敲除是在活體動物上驗證基因功能必不可少的邏輯環(huán)節(jié)，但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復(fù)雜的打靶載體構(gòu)建、ES細(xì)胞篩選、嵌合體動物模型選育等一系列步驟，成功率受到多方面因素的限制。第26頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四1.基因功能研究即使對于技術(shù)比較成熟的實驗室，利用傳統(tǒng)技術(shù)敲除大鼠或小鼠身上的某個基因一般也需要1年以上?；蚓庉嬓录夹g(shù)則不然，敲除基因高效快速，是研究基因功能的有力工具。第27頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四1.基因功能研究ZFN技術(shù)已在大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥、玉米、煙草等模式生物或經(jīng)濟(jì)物種的細(xì)胞或胚胎中以及包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)在內(nèi)的人體外培養(yǎng)細(xì)胞系中成功地實現(xiàn)了內(nèi)源基因的定點突變，其中在果蠅、斑馬魚、大鼠等物種中還獲得了可以穩(wěn)定遺傳的突變體。第28頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四1.基因功能研究2009年，威斯康辛醫(yī)學(xué)院、SangamoBiosciences、Sigma-Aldrich等多家機(jī)構(gòu)使用ZFN技術(shù)，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且?guī)в性撏蛔兊拇笫笏暮蟠瑯訋в性摶蛲蛔?。?9頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四2.基因治療傳統(tǒng)的基因治療是將正常的基因片段引入細(xì)胞中替代有缺陷的基因，但這種方法難以精準(zhǔn)控制，可能產(chǎn)生很大的毒副作用?；蚓庉嬓录夹g(shù)可以精確定位，在靶位點進(jìn)行修正或進(jìn)行基因切除，達(dá)到基因治療的目的。第30頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四2.基因治療Bacman等人利用TALEN技術(shù)清除了來自于病人線粒體內(nèi)的有病DNA。這是TALEN首次應(yīng)用于線粒體基因的編輯，這項研究有望用于治療母系遺傳的線粒體病。第31頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四2.基因治療Li等人利用ZFN技術(shù)能在染色體上精確定位的優(yōu)勢，通過“剪切”和“粘貼”基因，在實驗小鼠體內(nèi)實現(xiàn)了血友病治療，避免了傳統(tǒng)基因療法帶來的插入誘變風(fēng)險，首次取得了基因組編輯在基因療法上的突破。第32頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四3.構(gòu)建模式動物根據(jù)人類疾病所構(gòu)建的動物模型，對研究這些疾病的發(fā)生及其治療有著重要意義?；虼虬屑夹g(shù)是在ES和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，模型構(gòu)建耗時長、成本高，且模式動物的選擇受到ES細(xì)胞的限制。第33頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯新技術(shù)不受ES細(xì)胞的限制，效率高，速度快，且定點編輯更加精確，可在多種細(xì)胞及生物體的特定位點進(jìn)行切割和修飾。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠第一人Jaenisch與其同事最近利用CRISPR-Cas系統(tǒng)又構(gòu)建了攜帶特異性突變的小鼠模型。3.構(gòu)建模式動物第34頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四4.改造和培育新品種傳統(tǒng)的改造動植物品種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源DNA片段插入受體的基因組中，改造基因功能，使其表達(dá)優(yōu)良的性狀，獲得人類需要的品種。基因編輯技術(shù)則可以進(jìn)行定點修飾，達(dá)到高效定向。第35頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四Shukla等對玉米進(jìn)行肌醇磷酸激酶1(inositolphosphatekinase1，IPK1)基因的修飾，使其對除草劑的耐性增強，在發(fā)育的種子中肌醇磷酸鹽表達(dá)譜也發(fā)生了與預(yù)期一樣的改變。Townsend等以煙草中的丙酮醇合酶(acetolactatesynthase)基因SuR

(SuRA和SuRB)位點為靶標(biāo)，育成了對咪唑啉酮(imidazolinone)除草劑和對磺脲(sulphonylurea)除草劑都有抵抗力的新品種。第36頁，共42頁，2023年，2月20日，星期四基因編輯的不足基因編輯是一項新技術(shù)，還存在構(gòu)建復(fù)雜和價格的問題，其脫靶效應(yīng)限制了其在基因治療等應(yīng)用上的發(fā)展。第37頁，共42頁