微生物生長及其控制

微生物生長及其控制第1頁/共82頁

第一節(jié)微生物的生長一、研究微生物生長的兩個先決條件：純培養(yǎng)（pureculture）、同步生長(synchronousculture)純培養(yǎng)：從一個細胞或一種細胞群繁殖得到的后代。同步生長：所有細胞處于生長的相同階段，都能同時分裂。第2頁/共82頁微生物純培養(yǎng)的分離方法之一

稀釋倒平板法分離微生物第3頁/共82頁獲得純培養(yǎng)的方法微生物純培養(yǎng)的分離方法之二稀釋涂布法分離微生物第4頁/共82頁微生物純培養(yǎng)的分離方法之三

平板劃線法分離微生物第5頁/共82頁微生物純培養(yǎng)的分離方法之四單細胞挑取法：利用顯微操作儀，在顯微鏡下挑取一個單細胞進行培養(yǎng)微生物純培養(yǎng)的分離方法之五選擇培養(yǎng)基分離法：菌懸液進行適當稀釋涂布于選擇培養(yǎng)基上第6頁/共82頁獲得同步生長的方法1.選擇法：離心沉淀分離法、硝酸纖維素薄膜法、過濾分離法2.誘導法：是采用物理、化學因子使微生物細胞生長進行到某個階段而停下來，使先期到達該階段的微生物細胞不能進入下一生長階段，待全部群體細胞都到達該生長階段后，再除去該因子，使全部群體細胞同時進入下一個生長階段，以達到誘導微生物細胞同步生長的目的。

第7頁/共82頁選擇法第8頁/共82頁三、微生物群體生長的測定方法測定群體微生物細胞數(shù)目的增加測定群體微生物細胞物質(zhì)量的增加第9頁/共82頁（一）細胞量的測定1.干重法：將微生物菌體或離心得到的細胞沉淀物置100—105℃的烘箱中干燥至水份去除，直至恒重。2.氮量法：微量凱氏定氮法3.比濁法：菌液的濃度與渾濁度成正比（分光光度計測OD值）。4.生理指標法：消耗底物的量或產(chǎn)生的物質(zhì)量。第10頁/共82頁比濁法第11頁/共82頁（二）微生物細胞數(shù)目

的檢測方法1總細胞計數(shù)法1）血球計數(shù)板法第12頁/共82頁2）比例計數(shù)法：細菌懸液與等體積的血液混合涂片。第13頁/共82頁2活細胞計數(shù)法1）平皿菌落落計數(shù)法第14頁/共82頁第15頁/共82頁2)薄膜過濾平皿計數(shù)法第16頁/共82頁微生物生長測定方法比較方法特點與應用總細胞數(shù)血球計數(shù)板法較簡便，但較費時薄膜過濾染色法快速簡便，適于含菌數(shù)很低的空氣、水等中的總菌計數(shù)活細胞數(shù)

平皿菌落計數(shù)法簡易價廉，但花費時間較長，不能立刻知道結(jié)果薄膜過濾平皿法靈敏度高,不用于高密度培養(yǎng)物，不能立刻知道結(jié)果細胞濕重法較為簡便，但含水量不定，準確度差細胞成分含量法如測定蛋白質(zhì)、核酸、還原糖的含量等細胞干重法較為費時，較準確，但易受顆粒雜質(zhì)干擾

比濁法快速簡便，敏感度低，適于發(fā)酵液或液體中的快速總細胞計數(shù)，但需事先標定測定細胞數(shù)目測定物質(zhì)量第17頁/共82頁四、培養(yǎng)微生物的兩種方式（一）分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)

1.分批培養(yǎng)（batchculture）就是指將微生物置于一定容積的培養(yǎng)液中，經(jīng)過培養(yǎng)生長，最后一次收獲的培養(yǎng)方式。

2.連續(xù)培養(yǎng)(continuousculture)

基本上說來就是在一個恒定容積的流動系統(tǒng)中培養(yǎng)微生物，一方面以一定速率不斷地加入新的培養(yǎng)液，另一方面又以相同的速率流出培養(yǎng)物（菌體和代謝產(chǎn)物），以使培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞數(shù)量和營養(yǎng)狀態(tài)保持恒定，即處于穩(wěn)態(tài)。第18頁/共82頁（二）連續(xù)培養(yǎng)類型第19頁/共82頁連續(xù)培養(yǎng)類型恒濁連續(xù)培養(yǎng)：（內(nèi)控制菌體密度）可獲得最高的生長速率，用于工業(yè)生產(chǎn)以獲得大量的菌體及其代謝產(chǎn)物。恒化連續(xù)培養(yǎng)：（外控制流速）可獲得低于最高速率的生長速度，適于實驗室第20頁/共82頁（二）生長曲線1.指數(shù)生長公式：Nt=N0×2n

lgNt=lgN0+nlg2n=lgNt-lgN0=lgNt-lgN0

lg2

0.301式中N0為起始細胞數(shù)目，Nt為指數(shù)生長某個時刻t時的細胞數(shù)目，n為世代數(shù)。N0、Nt和t可由實驗獲得，n可通過上式計算得出。第21頁/共82頁世代：由1個細胞分裂成為2個細胞的時間間隔被稱為世代。代時：細胞每分裂一次所需的時間，也稱世代時間或者增代時間。第22頁/共82頁2.微生物生長曲線第23頁/共82頁1）延滯期（lagphase）延滯期特點:a生長速率等于零

b細胞合成新的成分，代謝活躍

c細胞形態(tài)變大或變長

d對外界不良環(huán)境敏感第24頁/共82頁影響延滯期長短的因素與實踐意義接種齡:對數(shù)期的“種子”，延滯期較短；延滯期或衰亡期的“種子”，延滯期較長接種量：接種量大，延滯期較短；接種量小，延滯期較長培養(yǎng)基成分:

培養(yǎng)基成分豐富的，延滯期較短培養(yǎng)基成分與種子培養(yǎng)基一致，延滯期較短第25頁/共82頁2）指數(shù)期(logphase)指數(shù)期特點

a生長速率最快，細胞呈指數(shù)增長

b生長速率恒定

c代謝旺盛，酶系活躍

d群體的生理特性較一致第26頁/共82頁影響指數(shù)期的因素

a菌種：不同菌種的代時差異極大；選擇對數(shù)期菌種、大量接種，代時短

b營養(yǎng)成分：營養(yǎng)越豐富，代時越短

c營養(yǎng)物濃度：影響微生物的生長速率和總生長量

d培養(yǎng)溫度：影響微生物的生長速率第27頁/共82頁指數(shù)期的實踐意義是代謝、生理等科研的良好材料是發(fā)酵生產(chǎn)中用作“種子”的最佳種齡是增殖噬菌體的最適宿主菌齡G+染色鑒定時采用此期微生物第28頁/共82頁3）穩(wěn)定期(stationaryphase)特點：活細胞總數(shù)維持不變，細胞生長速率為零，即新繁殖的細胞數(shù)與衰亡的細胞數(shù)相等菌體總數(shù)達到最高點芽孢桿菌此時開始形成芽孢，G+染色發(fā)生變化。初級代謝產(chǎn)物大量積累第29頁/共82頁為什么細胞總數(shù)不再增加？

營養(yǎng)物質(zhì)被消耗不能滿足生長需要代謝廢物或有害物質(zhì)積累到抑制生長水平

pH、氧化還原勢等物化條件越來越不適應第30頁/共82頁穩(wěn)定期的實踐意義是發(fā)酵生產(chǎn)中以菌體為終產(chǎn)品的最佳收獲期；某些代謝產(chǎn)物特別是次生代謝產(chǎn)物發(fā)生在此階段，某些細菌的芽孢也發(fā)生在此階段，故又稱作代謝產(chǎn)物合成期；導致了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝技術(shù)的改進。第31頁/共82頁4）衰亡期

(declinephase,deathphase)特點：細胞以指數(shù)速率死亡，細胞死亡速率超過新生速率，群體呈負增長細胞變形退化，有的發(fā)生自溶芽孢桿菌此期開始釋放芽孢合成或釋放抗生素等次生代謝產(chǎn)物第32頁/共82頁影響衰亡期的因素及實踐意義與菌種的遺傳特性有關(guān):有些細菌的培養(yǎng)經(jīng)歷所有的各個生長時期，幾天以后死亡,有些細菌培養(yǎng)幾個月乃至幾年以后仍然有一些活的細胞；與是否產(chǎn)芽孢有關(guān)：產(chǎn)芽孢的細菌更易于幸存下來；與營養(yǎng)物質(zhì)和有毒物質(zhì)有關(guān)：補充營養(yǎng)和能源，以及中和環(huán)境毒性，可以減緩死亡期細胞的死亡速率，延長細菌培養(yǎng)物的存活時間。第33頁/共82頁第二節(jié)理化因素對微生物的影響及利用理化因素對微生物的控制根據(jù)控制作用的效果分類滅菌（sterilization）:凡是能夠殺死或消除材料或物體上全部微生物的方法；消毒(disinfection):能夠殺死、消除或降低材料或物體上的病原微生物，使之不致引起疾病的方法；防腐(antisepsis):能夠防止或抑制霉腐微生物生長，但不能殺死微生物群體的方法。可防止食品霉腐。。第34頁/共82頁一、溫度最高溫度最低溫度最適溫度第35頁/共82頁第36頁/共82頁溫度對微生物影響的規(guī)律1.最適生長溫度時，生長繁殖速度最快。2.高溫滅菌的原理：超過最高生長溫度時，由于蛋白質(zhì)變性凝固，核酸變性，酶與核酸失去生物活性，不能正常代謝，而大量死亡。第37頁/共82頁低溫保藏菌種的原理低溫可降低酶的活性，所以微生物的代謝水平下降，生長繁殖暫時停滯，但仍能存活，一旦遇到合適的環(huán)境，又可生長繁殖。第38頁/共82頁低溫致死微生物的原因1.低于0℃時，許多微生物的細胞內(nèi)水分會轉(zhuǎn)變成冰結(jié)晶，引起細胞明顯脫水。2.許多細胞對脫水敏感，而不能存活。冰晶會對細胞質(zhì)膜產(chǎn)生物理損傷。3.干擾原生質(zhì)的膠體狀態(tài)。第39頁/共82頁防止低溫致死的方法1.快速冷凍：液氮。2.加保護劑：甘油。第40頁/共82頁高溫對微生物的影響1.高溫微生物抗熱的原因：酶對熱穩(wěn)定。蛋白質(zhì)合成機構(gòu)及其他結(jié)構(gòu)對熱具有抗性。膜中富含飽和脂肪酸，使膜在高溫下保持穩(wěn)定且具有功能。第41頁/共82頁2.高溫滅菌法1、干熱滅菌法

干熱滅菌：1500C～1700C下處理1-2小時。適用于玻璃器皿、金屬用具等耐熱物品的滅菌。優(yōu)點：可保持物品的干燥第42頁/共82頁1.火焰滅菌（灼燒滅菌）：常用于金屬性接種工具、污染物品及實驗材料等廢棄物的處理。馬釜爐2.烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法：干燥箱。第43頁/共82頁2.濕熱滅菌第44頁/共82頁在相同溫度下，濕熱的效力比干熱滅菌好的原因：①熱蒸汽對細胞成分的破壞作用更強

第45頁/共82頁②熱蒸汽比熱空氣穿透力強

③蒸汽潛熱大，當氣體轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w時可放出大量熱量，故可迅速提高滅菌物體的溫度。第46頁/共82頁2、濕熱滅菌（1）煮沸消毒：水，100℃處理15min以上。（2）高壓蒸汽滅菌(autoclave):

121℃，壓力為1kg/cm2或15b/in2）或0.1Mpa,時間維持20min，或113℃,壓力為0.6kg/cm2或8b/in2）或0.06Mpa,維持30min的方法。

適用于一切微生物學實驗，醫(yī)療結(jié)構(gòu)或發(fā)酵工廠中對培養(yǎng)基等多種器材、物料的滅菌。第47頁/共82頁該法不是利用高壓來殺死微生物，而是利用提高壓力使水的沸點升高，以提高水蒸汽的溫度，更加有效地殺滅微生物。

第48頁/共82頁第49頁/共82頁濕熱常壓：

蒸煮（80-100℃）間歇：煮沸后培養(yǎng)，再煮沸再培養(yǎng)，重復三次濕熱高壓：①121℃，壓力為1kg/cm2或15b/in2）,時間維持20～30min，②113℃，壓力為0.6kg/cm2或8b/in2

）,時間維持30～40min，第50頁/共82頁③連消法連續(xù)加壓蒸汽滅菌法（continuousautoclaving）或連消法（發(fā)酵行業(yè)）：

培養(yǎng)基在管道中流動過程中快速升溫，維持和冷卻，再入罐。135-140℃，5-15s.第51頁/共82頁連消法的優(yōu)點：1.高溫瞬時即徹底滅菌，又減少了營養(yǎng)消失，產(chǎn)量提高5-10%（如抗生素生產(chǎn)）。2.滅菌時間短，提高設備利用率。3.因為蒸汽負荷均衡，所以提高了鍋爐的利用效率。4.適宜自動化操作，降低勞動強度。第52頁/共82頁（3）間隙滅菌法(fractionalsterilizationortyndallization)

用80-100℃蒸汽或蒸煮15-60min，殺滅微生物的營養(yǎng)體，再置于適溫（37℃）培養(yǎng)，誘使其中殘存的芽孢發(fā)芽，次日再以同法蒸煮和保溫培養(yǎng)，如此重復3次。（適于芽孢菌及硫細菌）第53頁/共82頁（4）巴氏消毒法(pasteurization):低溫消毒法，一般在63℃,30min或72℃,15s。用于牛奶，啤酒，果酒，醬油等不能進行高溫滅菌的液體?？蓺⑺榔渲械牟≡缃Y(jié)核桿菌、傷寒桿菌等，同時又不損害營養(yǎng)與風味。第54頁/共82頁低溫維持法（LTH,lowtemperatureholdingmethod）,63℃,30min。高溫瞬時法（HTST，hightemperatureshorttime）,

72℃,15s

，第55頁/共82頁二、輻射有四種類型的輻射作用:紫外光、電離輻射、某種條件下的強可見光、微波等，可用作控制微生物的生長和保存食品。第56頁/共82頁1.紫外光

200—300nm范圍的紫外光殺菌作用最好。殺菌作用機制：使蛋白質(zhì)（約280nm）和核酸（約260nm）吸收變性失活；也可產(chǎn)生有毒的光化學產(chǎn)物-自由基，結(jié)合到DNA、RNA和蛋白質(zhì)分子上，干擾細胞的代謝過程。形成T=T,抑制DNA的 解鏈和復制紫外光穿透能力很差，不能穿過玻璃、衣物、紙張或大多數(shù)其他物體，但能夠在空氣中傳播，因而常用于消毒而不是滅菌。主要用作物體表面或室內(nèi)空氣的殺菌。也有采用特殊的紫外光輻射裝置替代加熱或漂白粉處理方法消毒像飲用水等液體。第57頁/共82頁fu第58頁/共82頁2.電離輻射主要使用X射線和γ射線。當X射線或γ射線撞擊分子時，形成離子和自由基分子，故可稱電離輻射。使DNA鏈斷裂，電離輻射產(chǎn)生H2O2，使蛋白質(zhì)發(fā)生變化，細胞受到損傷或死亡。電離輻射主要用于其他方法所不能解決的塑料制品、醫(yī)療設備、藥品和食品的滅菌。第59頁/共82頁第60頁/共82頁3.強可見光400—700nm波長范圍的強可見光也具有直接的殺菌效應，它們能夠氧化細菌細胞內(nèi)的光敏感分子，如核黃素和卟啉環(huán)（構(gòu)成氧化酶的成分）。實驗室應注意避免將細菌培養(yǎng)物暴露于強光下。此外，曙紅和四甲基藍能夠吸收強可見光使蛋白質(zhì)和核酸氧化，因此常將兩者結(jié)合用作滅活病毒和細菌。4.微波微波是一種紅外線。微波并不直接影響微生物,但可通過被輻照物體產(chǎn)熱而殺死微生物。然而由于微波加熱食品通常存在不均勻問題,微生物逃逸微波加熱現(xiàn)象常會發(fā)生。第61頁/共82頁三、重金屬及重金屬鹽是蛋白質(zhì)的沉淀劑，可引起蛋白質(zhì)變性或與酶的巰基結(jié)合，使酶失活，高濃度可引起細胞死亡。第62頁/共82頁四、強酸、強堿及有機化合物均是很好的殺菌劑強酸可破壞DNA、ATP、葉綠素、酶等。強堿可破壞RNA、磷脂、酶等。醇是脫水劑，蛋白質(zhì)變性劑、脂溶劑，可使蛋白質(zhì)變性。第63頁/共82頁為什么用75%乙醇作消毒劑？1.濃度過高，可使菌體表面層蛋白質(zhì)很快凝固，而阻止乙醇向內(nèi)滲入。2.高濃度的乙醇，易揮發(fā)，故消毒的時間短，效果差。第64頁/共82頁五、超聲波與滲透壓

可引起細胞結(jié)構(gòu)破壞，細胞破裂，最終導致微生物死亡。

“空穴作用”第65頁/共82頁六、表面活性劑、化學染料等表面活性劑就是能降低表面張力效應的物質(zhì)，可使蛋白質(zhì)變性，細胞膜破壞。常見的表面活性劑：新潔爾滅?；瘜W染料可與蛋白質(zhì)的羧基結(jié)合，起到抑菌的作用。第66頁/共82頁石炭酸系數(shù)

在一定時間內(nèi)，被試藥劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達到同效的是石炭酸最高稀釋度的比值。一般規(guī)定處理時間是10分鐘，供試菌是Salmonellatyphi

(鼠傷寒沙門氏桿菌)。第67頁/共82頁第三節(jié)化學治療劑對微生物的作用一、化學療劑對微生物的作用：化學治療劑是指那些能夠特異性地作用于某些微生物并具有選擇性的化學藥劑，它們與非特異性的化學藥劑相比對人體幾乎沒有什么毒性或毒性很小，可用作治療微生物引起的疾病。第68頁/共82頁1、抗代謝藥物

定義：是指一類在化學結(jié)構(gòu)上與細胞內(nèi)必要代謝物的結(jié)構(gòu)相似，并可干擾正常代謝活動的化學物質(zhì)。第69頁/共82頁最常用的是磺胺類藥物?；前放c葉酸合成前體對氨基苯甲酸（PABA）的結(jié)構(gòu)類似。葉酸是輔酶，在氨基酸、維生素、核酸和蛋白質(zhì)合成中起重要作用，很多細菌需要自己合成葉酸才能生長。第70頁/共82頁第71頁/共82頁為什么磺胺對人體細胞無毒性？

因為人缺乏從對氨基苯甲酸合成葉酸的相關(guān)酶二氫蝶酸合成酶、二氫葉酸合成酶和二氫葉酸還原酶，故不能用外界提供的對氨基苯甲酸自行合成葉酸，而必須直接利用營養(yǎng)物中的葉酸做為生長因子。第72頁/共82頁2、抗生素

抗生素是一類由微生物或其它生物生命活動過程中合成的次生代謝產(chǎn)物或其人工衍生物，它們在很低濃度時就能抑制或干擾它種生物（包括病原菌、癌細胞等）的生命活動，因而可用作優(yōu)良的化學治療劑。第73頁/共82頁抗生素最初是由英國科學家弗來明（A.Fleming）在20年代末期偶然發(fā)現(xiàn)的，40年代初才作為化學治療劑生產(chǎn)問世。青霉素抑制藤黃微球菌的生長

抗生素的抗菌譜：抗生素的作用對象的范圍。通常將對多種類群的細菌有作用的抗生素稱為廣譜抗生素，如四環(huán)素和土霉素既對G＋又對G—細菌有作