微生物分離純化接種與培養(yǎng)技術(shù)

微生物分離純化接種與培養(yǎng)技術(shù)第1頁(yè)/共17頁(yè)細(xì)菌的分離純化一、目的要求：1、學(xué)習(xí)微生物純系分離、培養(yǎng)方法。2、掌握劃線分離純化微生物的方法。二、基本原理：為了生產(chǎn)和科學(xué)研究的需要，往往需要從自然界混雜的微生物群中分離單一的菌種，這種獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離。第2頁(yè)/共17頁(yè)第一節(jié)微生物純培養(yǎng)二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)1、稀釋平板分離法：傾注平板法和涂布平板法?；具^(guò)程：（1）梯度稀釋過(guò)程；（2）分離培養(yǎng)過(guò)程涂布傾注梯度稀釋過(guò)程10-110-210-310-410-510-6第3頁(yè)/共17頁(yè)固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)１、稀釋倒平板法：稀釋－－不同稀釋液少許與50oC左右的瓊脂培養(yǎng)基混合—傾入平皿。2、涂布平板法：稀釋－－傾入平皿－－不同稀釋液少許涂布在瓊脂培養(yǎng)基。3、平板劃線分離法：少許待分離物—平板劃線（連續(xù)劃線和分區(qū)劃線）。4、稀釋搖管法：待分離物用培養(yǎng)基稀釋—搖勻—在瓊脂表面封石蠟。液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)同一稀釋度做多個(gè)平行管，95%表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。第4頁(yè)/共17頁(yè)二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)4)操作要點(diǎn)：

無(wú)菌操作稀釋平板分離法使用過(guò)程中的幾個(gè)問(wèn)題1)梯度稀釋度的確定：需分離微生物在樣品中的數(shù)量2)選擇菌落接種的依據(jù)：

a、菌落特征；b、菌體的特征3)微生物純培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)：菌落特征一致性第5頁(yè)/共17頁(yè)固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)菌落:單個(gè)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長(zhǎng)、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長(zhǎng)群體。菌苔：當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時(shí)。平板（培養(yǎng)平板）：它是指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的平皿。第6頁(yè)/共17頁(yè)3、平皿劃線法用接種環(huán)沾少許待分離的材料，在培養(yǎng)基表面進(jìn)行多次平行劃線，使微生物細(xì)胞分開生長(zhǎng)以獲得微生物純培養(yǎng)的過(guò)程。第7頁(yè)/共17頁(yè)2、單細(xì)胞挑取法：從待分離材料中挑取一個(gè)細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)，從而獲得純培養(yǎng)的過(guò)程。第8頁(yè)/共17頁(yè)單細(xì)胞（單孢子）分離在顯微鏡下用毛細(xì)管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單細(xì)胞（單孢子）培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)分離1、利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離。2、富集培養(yǎng)（多次培養(yǎng)后再分離）二元培養(yǎng)物：培養(yǎng)物中含有二種微生物。寄生物如病毒，原生動(dòng)物如纖毛蟲。第9頁(yè)/共17頁(yè)

為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，可采用下列兩種方法：一種是提供有利于該微生物生長(zhǎng)繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。如要從土壤中分離自生固氮菌，則其培養(yǎng)基中是不能含有N源，這種培養(yǎng)基就比較適于能利用空氣中N2的微生物。另一種方法是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制人們所不需要的微生物的生長(zhǎng)繁殖。分離土壤中真菌，往往在分離真菌的馬丁培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)拿霞永t，鏈霉素和金霉素等化學(xué)藥品，目的在于抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，這樣更有利于獲得其純培養(yǎng)。tupian第10頁(yè)/共17頁(yè)

土壤中微生物數(shù)量眾多，在肥沃土壤中固氮菌數(shù)量也很多，自然界中多數(shù)氮素養(yǎng)料是由微生物固氮的結(jié)果，固氮菌一般可分為自生固氮菌和共生固氮菌兩類。要分離自生固氮菌，常用阿斯畢無(wú)氮培養(yǎng)基這種選擇培養(yǎng)基，控制其適宜環(huán)境條件，使它在培養(yǎng)基上大量繁殖，然后通過(guò)稀釋法和劃線分離純化法，使它在培養(yǎng)基上形成單菌落，如分離所得不純，需要進(jìn)一步純化，直到得到純種.第11頁(yè)/共17頁(yè)三、材料與儀器1、培養(yǎng)基：阿斯畢無(wú)氮培養(yǎng)基。2、菜園土。3、滅菌培養(yǎng)皿、鑷子、剪刀、接種針、酒精燈等第12頁(yè)/共17頁(yè)四、方法與步驟（一）富集培養(yǎng)：:(上次已做實(shí)驗(yàn))1、加入1ML土壤菌懸液于滅菌平板2、加入已滅菌后冷卻至50oC左右的阿斯畢培養(yǎng)基，混勻。3、正面放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，28oC培養(yǎng)3~4天后，在土粒周圍有混濁半透明的膠狀菌落出現(xiàn)，有的在后期會(huì)產(chǎn)生褐色的色素。第13頁(yè)/共17頁(yè)（二）劃線分離純化1、用已溶化至50oC阿斯畢培養(yǎng)基倒入平板。2、用接種環(huán)挑取上述菌落少許，在冷凝平板上進(jìn)行劃線分離，而后置28oC培養(yǎng)4天。劃線方法如圖：1234第14頁(yè)/共17頁(yè)（三）純化、鏡檢，得到純種培養(yǎng)1、平板上出現(xiàn)單菌落，按無(wú)菌操作移入阿斯畢培養(yǎng)基斜面試管中，28oC培養(yǎng)4天。2、鏡檢：將斜面菌株進(jìn)行涂片、染色、鏡檢。如是粗短桿狀或球狀的單一形態(tài)的菌體細(xì)胞較大，常呈單個(gè)或“8”字排列，在細(xì)胞表面有較厚的莢膜者，即為自生固氮菌。如有雜菌，需要進(jìn)一步劃線純化。3、將得到純化菌株，移接到另一阿斯畢培養(yǎng)基斜面管，28oC培養(yǎng)3~4天，即獲得純培養(yǎng)菌，可冷凍保存，備用。第15頁(yè)/共17頁(yè)五、注意事項(xiàng)：（1）在微生物分離、純化每一操作環(huán)節(jié)，要嚴(yán)