兒童常見疾病的實驗室診斷

兒童常見疾病的實驗室診斷前言感染性疾病是嚴(yán)重威脅兒童生命與健康的首要元兇，至今全世界每年有1300萬兒童死于感染性疾病。我國兒童疾病譜已發(fā)生重大變化，先天性遺傳代謝性疾病、腫瘤、變態(tài)反應(yīng)性疾病和心理行為異常等的發(fā)生率有所上升，但感染性疾病仍是兒童時期最常見的疾病。兒童感染性疾病的病原體包括細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體及寄生蟲等2020/11/42兒童常見感染性疾病

的病原學(xué)特點2020/11/43急性上呼吸道感染病原體以病毒為主,占原發(fā)上感的90%以上，支原體和細菌較少見。常見病毒:柯薩奇病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等肺炎支原體：不但可引起肺炎，也可引起上感，肺炎多見于5-14歲小兒常見細菌：溶血性鏈球菌A組、肺炎鏈球菌、嗜血流感桿菌及葡萄球菌2020/11/44多見于嬰幼兒，與其呼吸系統(tǒng)生理解剖特點有關(guān)：支氣管腔窄，纖毛運動差，血管豐富等，加上免疫防御功能尚未充分發(fā)育。WHO調(diào)查顯示，2002-2006年全球<5歲兒童死亡原因中肺炎居首位(19%)。按病原體分類：細菌性肺炎、病毒性肺炎、真菌性肺炎、支原體肺炎、衣原體肺炎等。明確兒童肺炎的病原學(xué)特點，作出正確診斷，對肺炎的治療具有重要的指導(dǎo)意義。肺炎2020/11/45研究報道，在北京兒童醫(yī)院下呼吸道感染的病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果：病原陽性58.5%，單純細菌感染25%、單純病毒感染32%、支原體感染13%、混合感染28%。常見病原中，RSV占28.4%，肺炎鏈球菌占16.7%、流感嗜血桿菌13.7%芬蘭對254例社區(qū)獲得性肺炎的病原學(xué)研究結(jié)果，住院的肺炎病人中85%可找到病原學(xué)證據(jù)，其中62%為病毒感染，53%為細菌感染，30%為混合感染。最常見的病原為：肺炎鏈球菌（37%），RSV（29%）和鼻病毒（24%）2020/11/460~20天B族鏈球菌、革蘭氏陰性腸道細菌、CMV3周~3月RSV、副流感病毒、肺炎鏈球菌、金葡菌等4月~4歲RSV、ADV、流感及副流感病毒、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌屬等5~15歲肺炎支原體、肺炎衣原體、肺炎鏈球菌等兒童不同年齡段的社區(qū)獲得性肺炎的病因2020/11/47常見病毒：呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(IFV)、副流感病毒(PIFV)、腺病毒(ADV)、巨細胞病毒(CMV)、腸道病毒(EV)、鼻病毒(RV)及麻疹病毒等。有研究報道，304例病毒性肺炎兒童呼吸道標(biāo)本病毒抗原檢測，陽性病毒株中，RSV占23%，ADV占15%，IFV-A占24%，IFV-B占16%，副流感病毒(PIFV)占5%病毒性肺炎2020/11/48常見細菌：肺炎鏈球菌、B型嗜血桿菌、化膿性鏈球菌、革蘭氏陰性腸道菌有研究報道，細菌性肺炎患兒中以肺鏈感染最多，其次為表皮葡萄球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌。年齡因素：肺鏈可見于各年齡期，金黃色葡萄球菌，B組鏈球菌及腸桿菌屬主要發(fā)生在6月尤其3個月以內(nèi)的嬰幼兒，流感嗜血桿菌好發(fā)于3個月到5歲。細菌性肺炎2020/11/49我院09年痰標(biāo)本中細菌分離情況2020/11/410ESBLs(超廣譜β--內(nèi)酰胺酶)主要由大腸埃希菌和克雷伯菌屬菌產(chǎn)生是由質(zhì)粒介導(dǎo)，水平傳播，能水解亞氨基β--內(nèi)酰胺，并可被β--內(nèi)酰胺酶抑制劑（克拉維酸等）所抑制的一類酶易在不同菌株間傳播對青霉素類，頭孢菌素類及單環(huán)類治療無效（無論體外試驗是否敏感）2020/11/411湖北地區(qū)ESBLs菌株檢出率20032004200520062007200820092020/11/412耐苯唑西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）

由于低親合力青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a

）的產(chǎn)生，對抗菌藥物的親和力降低，對多種作用青霉素結(jié)合蛋白（PBPS）的抗菌藥物均耐藥對所有青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和酶抑制劑的復(fù)合制劑均應(yīng)報告耐藥，而不考慮其體外藥敏的結(jié)果.對MRSA的首選藥物是糖肽類藥物萬古霉素2020/11/413

湖北地區(qū)MRSA流行率20032004200520062007200820092020/11/414在我國屬第二位常見多發(fā)病，僅次于呼吸道感染，是兒童患病和死亡的主要原因,也是營養(yǎng)不良的重要原因。WHO統(tǒng)計,除中國外，全世界每年有10億人患腹瀉,其中5億發(fā)生在發(fā)展中國家.我國衛(wèi)生部疾病控制司的調(diào)查結(jié)果顯示,我國每年有8.36億人次患腹瀉,其中5歲以下兒童占3億人次,5歲以下兒童的年發(fā)病率平均為1.9次/人小兒腹瀉病2020/11/415包括細菌性痢疾、阿米巴痢疾、傷寒沙門氏菌腸炎、致病大腸桿菌腸炎、空腸彎曲菌腸炎、輪狀病毒腸炎、真菌性腸炎等。夏季腹瀉：其主要病原菌為致病性大腸桿菌與痢疾桿菌；秋季腹瀉：在1973年，被澳大利亞學(xué)者用電鏡在十二指腸粘膜活檢標(biāo)本及糞便中發(fā)現(xiàn)，命名為輪狀病毒。隨著經(jīng)濟發(fā)展，衛(wèi)生條件改善，細菌性腹瀉愈來愈少，而病毒性腹瀉發(fā)病率相對升高。小兒腹瀉病2020/11/416好發(fā)于6個月至2歲嬰幼兒，多發(fā)生在10、11、12、1月秋冬季。在病毒性腹瀉中以輪狀病毒腸炎發(fā)病率最高，癥狀較重。在中國小兒腹瀉病病原構(gòu)成比中，輪狀病毒約占40%，位居第一位。輪狀病毒腸炎2020/11/417是世界各國兒童致殘和死亡的重要原因之一；主要包括病毒性腦膜炎和腦炎、化膿性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎；其臨床特點為發(fā)熱、頭痛、嘔吐、煩躁不安、驚厥、嗜睡、昏迷、

前囟隆起、頸項強直、

腦脊液改變。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染2020/11/418疫苗接種能預(yù)防許多病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，如脊髓灰質(zhì)炎、麻疹腦炎、腮腺炎腦膜腦炎、乙型腦炎等；仍有許多其他病毒感染對發(fā)育期和成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重危害。主要包括：腸道病毒屬：柯薩奇病毒、埃可病毒、腸道病毒71型等，皰疹病毒屬：單純皰疹病毒、人類皰疹病毒6型、巨細胞病毒、EB病毒、水痘病毒等。實驗結(jié)果顯示，武漢地區(qū)腸道病毒腦膜炎占無菌性腦膜炎的80％左右；且培養(yǎng)結(jié)果顯示，多數(shù)腸道病毒血清型可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，多呈散發(fā)，某些血清型可引起局部暴發(fā)流行，血清型與臨床損害缺乏明確的對應(yīng)關(guān)系病毒性腦炎2020/11/419腦脊液檢查一般顯示細胞數(shù)有輕到中度增高，通常以單核細胞為主。腦脊液中蛋白可輕度增高，糖、氯化物往往正常。通常難以從血液或腦脊液中分離到病毒，利用PCR技術(shù)檢查腦脊液中病毒核酸已成為病原診斷的常用方法。病毒性腦炎-CSF檢查2020/11/420簡稱化腦，尤其是嬰幼兒較常見，系由各種化膿菌感染引起的腦膜炎癥。使用抗生素以來其病死率已由50％～90％降至10％以下，但因致殘率高，神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥發(fā)生率占存活兒的1／3，因此仍是小兒嚴(yán)重感染性疾病之一。臨床以發(fā)熱、嘔吐、頭痛及精神改變等癥狀、腦膜刺激征和腦脊液改變?yōu)樘卣?。化膿性腦膜炎2020/11/421據(jù)美國資料,化腦的人群年發(fā)病率為1／萬～5／萬；5歲以下小兒的年發(fā)病率達8.7／萬，5歲以上者僅0．22／萬；2歲以內(nèi)發(fā)病者約占本病的75％，高峰發(fā)病年齡為6～12個月。在我國,腦膜炎球菌、肺炎鏈球菌及流感桿菌引起的化腦占小兒化腦總數(shù)2／3以上。不同年齡小兒感染的致病菌也有很大差異。新生兒易發(fā)生腸道革蘭陰性桿菌腦膜炎，其中大腸桿菌占第一位，其次為金黃色葡萄球菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣桿菌等?；撔阅X膜炎2020/11/422化腦患兒白細胞總數(shù)及中性粒細胞明顯增加，貧血常見于流感桿菌腦膜炎。早期未用抗生素治療者，血及腦脊液培養(yǎng)可得陽性結(jié)果，能幫助確定病原菌。腦脊液常規(guī)可見典型化膿性改變。其外觀混濁或稀米湯樣，壓力增高。鏡檢白細胞甚多，每升可達數(shù)百至數(shù)萬，其中以多核細胞為主。糖定量常<2mmol／L。蛋白定性試驗多為強陽性，定量常在1g／L以上。將腦脊液離心沉淀，作涂片染色，常能見病原菌。化膿性腦膜炎-CSF檢查2020/11/423病原學(xué)診斷是兒童感染性疾病診治中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。可大大提高臨床診斷水平，判斷療效。指導(dǎo)合理應(yīng)用抗生素并考核其療效，遏制與延緩耐藥菌株的產(chǎn)生。為研究感染性疾病的致病機制和流行病學(xué)特點，指導(dǎo)有效預(yù)防、控制與管理措施提供有力依據(jù)。病原學(xué)診斷的作用2020/11/424病原學(xué)實驗室診斷

的常用技術(shù)2020/11/425傳統(tǒng)方法以病原體的分離培養(yǎng)和鑒定為主體，至今仍是許多感染性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)需時長、費用高、陽性率低等新的病原學(xué)診斷技術(shù)應(yīng)用單克隆抗體的各種免疫學(xué)檢測技術(shù)核酸雜交技術(shù)核酸擴增技術(shù)流式細胞術(shù)等

新技術(shù)使病原體的檢測變得更敏感、特異和快速，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景病原學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展2020/11/426分離培養(yǎng)與鑒定技術(shù)形態(tài)學(xué)檢測技術(shù)免疫學(xué)檢測技術(shù)基因診斷技術(shù)流式細胞術(shù)病原學(xué)診斷技術(shù)分類2020/11/427培養(yǎng)與鑒定技術(shù)對病原體的分離培養(yǎng)不僅能使感染性疾病得以確診，而且建立在此基礎(chǔ)上的藥敏試驗可指導(dǎo)臨床合理用藥,如痰培養(yǎng)、咽拭培養(yǎng)、血培養(yǎng)等。但是某些病原體目前還無法進行體外培養(yǎng)，或培養(yǎng)步驟繁復(fù)而無法在小型實驗室常規(guī)開展，如支、衣原體、病毒等更重要的是許多兒科感染常見病原體的培養(yǎng)結(jié)果無法及時獲取以指導(dǎo)臨床治療，這些缺點大大限制了分離培養(yǎng)技術(shù)在病原學(xué)診斷中的應(yīng)用。2020/11/428光鏡檢查：各種標(biāo)本(血、尿、糞、腦脊液、胸腹水、骨髓、膿液、皮膚瘀點等)制成的涂片，進行革蘭或特殊染色后可置普通光學(xué)顯微鏡下直接觀察，這是確定很多感染性疾病病原體的最基本和快速的方法。電鏡檢查：主要用于觀察細菌、病毒等的超微結(jié)構(gòu)，對病毒感染尤其具有快速診斷的價值。形態(tài)學(xué)檢測技術(shù)2020/11/429免疫學(xué)檢測技術(shù)(1)其基本原理是抗原抗體反應(yīng)，可利用單克隆抗體檢測病原體的特異性抗原，也可利用病原體抗原檢測患者體內(nèi)的特異性抗體。在病毒、支原體、衣原體、立克次體等難培養(yǎng)病原體的診斷中具有很大的實用價值。2020/11/430免疫學(xué)檢測技術(shù)(2)酶免疫技術(shù)(EIA)：具有高度的特異性和敏感性，幾乎所有可溶性抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)均可檢測，最小可測值可達納克甚至皮克水平，且與IFA比較具有操作簡便、結(jié)果易判定、重現(xiàn)性好等優(yōu)點。ELISA：MP,CP-IgM，RSV、ADV、CMV、EB、細小病毒等病毒的IgM、IgG免疫印跡法：過敏原、ENA等膠體金技術(shù)：HRV、HbsAg等2020/11/431ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗)2020/11/432免疫學(xué)檢測技術(shù)(3)免疫熒光技術(shù)(IFA):是用熒光素標(biāo)記抗體分子，借助熒光顯微鏡檢測相應(yīng)抗原或抗體，分直接法和間接法。該方法可清楚的觀察病原體抗原并定位，具有簡單、敏感、特異等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于病毒感染性疾病的診斷。RSV、ADV、IFV、PIFV、嗜肺軍團菌、Q熱立克次體、MP、CP等2020/11/433免疫熒光技術(shù)(IFA)2020/11/434免疫熒光技術(shù)(IFA)2020/11/435免疫學(xué)檢測技術(shù)(3)間接凝集反應(yīng)：包括正向間接凝集反應(yīng)和反向間接凝集反應(yīng)。正向間接凝集反應(yīng)是以抗原致敏載體檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體，反向間接凝集反應(yīng)是以抗體致敏載體檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗原。由于其操作簡便、反應(yīng)快速，因而常用于流行病學(xué)調(diào)查和篩選陽性標(biāo)本。在標(biāo)本中直接檢出細菌抗原，有利于感染性疾病的早期診斷。應(yīng)用：MP-Ab,TP等,2020/11/436基因診斷技術(shù)(1)核酸雜交技術(shù)：不同病毒其核苷酸排列不相同，因此利核酸鏈間堿基互補的原理進行基因診斷，即雜交技術(shù)。優(yōu)點是特異性強、敏感度高。缺點是實驗條件要求嚴(yán)格，需要精密先進的設(shè)備，尚未能常規(guī)用于感染性疾病的病原學(xué)診斷。常用方法有斑點雜交、Southern印跡、Northern印跡、原位雜交等。2020/11/437基因診斷技術(shù)(1)核酸擴增技術(shù)：以聚合酶鏈反應(yīng)PCR技術(shù)最常用和最成熟。PCR技術(shù)在敏感性、特異性、檢測速度等方面的強大優(yōu)勢使其越來越廣泛的被應(yīng)用于各種感染的病原學(xué)診斷。應(yīng)用：HBVDNA，CMV、EB、MPDNA，HCV、RSV-RNA，TB、肺炎鏈球菌等2020/11/438基因診斷技術(shù)(2)基因定量診斷技術(shù)：是在聚合酶鏈反應(yīng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，包括核酸雜交定量技術(shù)和PCR定量技術(shù)，主要用于數(shù)種病毒基因的定量分析，如HIVA型、HBV、HCV、CMV、HPV等。實時熒光定量PCR法為目前應(yīng)用最廣的基因定量診斷技術(shù)，根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強度即可計算出初始模板的數(shù)量，具有自動化程度高、動態(tài)監(jiān)測、防止污染等優(yōu)點?？捎糜诓∏樵u估、療效預(yù)測、預(yù)后判斷等，在感染性疾病診斷中具有重要的臨床應(yīng)用價值。2020/11/439實時熒光定量PCR