人體寄生蟲(chóng)分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究進(jìn)展

1概述：

人體寄生蟲(chóng)學(xué)定義人體寄生蟲(chóng)學(xué)（humanparasitology）是研究與人體健康有關(guān)的寄生蟲(chóng)的形態(tài)、生活史、致病、實(shí)驗(yàn)診斷方法、流行因素與防治措施的科學(xué)，是預(yù)防醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的一門(mén)基礎(chǔ)學(xué)科。一、前言現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三按動(dòng)物分類(lèi)系統(tǒng)分類(lèi)，人體寄生蟲(chóng)隸屬于動(dòng)物界的五個(gè)門(mén)：原生動(dòng)物門(mén)（PhylumProtozoa)——原蟲(chóng)扁形動(dòng)物門(mén)（PhylumPlatyhelminthes)——吸蟲(chóng)、絳蟲(chóng)線形動(dòng)物門(mén)（PhylumNemathelminthes)——蛔蟲(chóng)棘頭動(dòng)物門(mén)（PhylumAcanthocephala)——棘頭蟲(chóng)節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(PhylumArthropoda)————醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)

習(xí)慣上分為：原蟲(chóng)、蠕蟲(chóng)(吸蟲(chóng)、絳蟲(chóng)、線蟲(chóng))、醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)三大類(lèi)。2人體寄生蟲(chóng)分類(lèi)現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)代熱帶?。╓HO2000）瘧疾（malaria）感染人數(shù)4億～4.9億；每年死亡人數(shù)220～250萬(wàn)。血吸蟲(chóng)病（schistosomiasis）流行于76個(gè)國(guó)家，5億~6億人口受威脅，2億人感染，每年死亡人口50～100萬(wàn)。

絲蟲(chóng)?。馨秃捅P(pán)尾絲蟲(chóng)病filariasis)

流行于80多個(gè)國(guó)家，1.45億人感染。3寄生蟲(chóng)的危害性現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三晚期絲蟲(chóng)病人（下肢象皮腫）晚期血吸蟲(chóng)病人現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三利什曼?。╨eishmaniasis）現(xiàn)感染人口1200萬(wàn)人錐蟲(chóng)病（非洲和美洲錐蟲(chóng)trypanosomiasis）單單美洲錐蟲(chóng)感染者1800萬(wàn)。麻風(fēng)病（leprosy）結(jié)核?。╰uberculosis）登革熱（date-fever）媒介昆蟲(chóng)傳染的疾病現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三東方癤現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三4背景：

動(dòng)物寄生蟲(chóng)的分子生物學(xué)研究始于20世紀(jì)90年代中期，雖然起步較晚，但進(jìn)展極快。近10年來(lái)，研究廣度已涉及所有重要的寄生原蟲(chóng)，并已擴(kuò)展到了具有重要公共衛(wèi)生意義的部分寄生蠕蟲(chóng)，研究深度已進(jìn)入寄生蟲(chóng)的基因序列測(cè)定分析、分類(lèi)比對(duì)鑒定、診斷方法的建立和免疫學(xué)研究領(lǐng)域，建立了近50種寄生蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)?，F(xiàn)在是7頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三5意義：☆揭示生命科學(xué)的規(guī)律?！顬閯?dòng)物寄生蟲(chóng)病的研究和防控工作展示了新的前景。現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三二、寄生蟲(chóng)基因組學(xué)研究進(jìn)展1.寄生蟲(chóng)的基因組成和特點(diǎn)

相對(duì)于高等脊椎動(dòng)物,寄生蟲(chóng)基因組除了核(染色體)DNA之外,還有線粒體(mitochondrian)DNA、動(dòng)基體(kineto-plast)DNA（利什曼原蟲(chóng)，分類(lèi)和臨床診斷）和質(zhì)體(plastid)DNA（頂復(fù)門(mén)寄生蟲(chóng)，如：瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、巴貝蟲(chóng)和艾美球蟲(chóng)，分類(lèi)和臨床診斷）等。在一些低等的寄生原蟲(chóng)中,甚至沒(méi)有成型的線粒體DNA,如某些阿米巴除了染色體DNA外,只有類(lèi)似細(xì)菌質(zhì)粒的環(huán)狀DNA和胞質(zhì)DNA。現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三基因組大小:寄生蟲(chóng)染色體基因組的大小差別較大,其中,微孢子蟲(chóng)Microsporidia基因組的大小不到10Mb,在整個(gè)真核生物中最小;血吸蟲(chóng)基因組為270Mb,相當(dāng)于人類(lèi)基因組的1/10重復(fù)序列：高度、中度和單拷貝重復(fù)序列,不同的寄生蟲(chóng)重復(fù)序列所占的比例不同堿基含量:寄生蟲(chóng)基因組堿基G+C含量在30%-40%之間,AT含量豐富現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三線粒體DNA：

線粒體DNA具有母系遺傳和快速進(jìn)化的特點(diǎn),較染色體DNA更易反映種、株乃至型間差異,由于具有較好的穩(wěn)定性,因此通常被用來(lái)評(píng)價(jià)物種的種系發(fā)生。目前已對(duì)血吸蟲(chóng)、惡性瘧原蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、單殖吸蟲(chóng)(Microcotylesebastis,G.thymalli,G.salaris,G.derjavin-oides)、血吸蟲(chóng)(S.japonicum,S.mekongi,S.mansoni,S.haematobium,S.spindale)、肝片吸蟲(chóng)Fasciolahepatica、衛(wèi)氏并殖吸蟲(chóng)Paragonimuswestermani及絳蟲(chóng)(Hymenolepisdiminuta,Taeniaasiatica,T.solium,T.crassiceps,E.multilocularis,E.granulosus)等多種寄生蟲(chóng)的全線粒體基因組作了測(cè)序分析(Littlewoodetal.,2006;Valles&Boore,2006;Parketal.,2007;Plaisanceetal.,2007;Huyseetal.,2007、2008)?，F(xiàn)在是11頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三2.寄生蟲(chóng)基因組測(cè)序現(xiàn)狀目前寄生蟲(chóng)基因組測(cè)出的序列主要分3類(lèi):A.完整或接近完整的基因組序列,主要是可讀框區(qū)的重復(fù)序列,通常用重疊群(contigs)表示;B.基因組測(cè)序序列標(biāo)簽(GSSs),主要有瀏覽基因組序列產(chǎn)生或隨機(jī)克隆、細(xì)菌人工載體(BAC)末端序列,用來(lái)擴(kuò)增大片段的DNA（200kb左右);C.表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs),由mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA,并擴(kuò)增后進(jìn)行的測(cè)定序列。已經(jīng)完成基因組測(cè)序的寄生蟲(chóng)包括惡性瘧原蟲(chóng)、約氏瘧原蟲(chóng)P.yoelii、馬來(lái)布魯線蟲(chóng)Brugiamalayi、克氏錐蟲(chóng)T.cruzi、小隱孢子蟲(chóng)Cryptosporidiumparvum及岡比亞按蚊Anophelesgambiae等的基因組全序列現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三意義：☆基因組分析過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了大約200種蛋白的基因，這些蛋白質(zhì)參與了免疫逃避。以前的研究顯示，在某種復(fù)雜的掩護(hù)機(jī)制之下，寄生蟲(chóng)通過(guò)在細(xì)胞表面表達(dá)不同的蛋白質(zhì)來(lái)逃避宿主的免疫反應(yīng)。☆發(fā)現(xiàn)編碼參與代謝途徑蛋白的基因，蟲(chóng)體存在而人體不存在的特有途徑中的基因是潛在的藥物靶標(biāo)。現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三☆比較惡性瘧原蟲(chóng)與瘧原蟲(chóng)其他種的序列，可以闡明特定株特異性的基因和生理過(guò)程。或者比較惡性瘧原蟲(chóng)不同株的序列，可以快速地鑒定與免疫、發(fā)病機(jī)制和人侵有關(guān)的變異?！钔ㄟ^(guò)功能基因組高通量技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)DNA微陣列檢測(cè)基因的表達(dá)。例如，分離不同時(shí)期的DNA微陣列，確定基因的表達(dá)變化，對(duì)于特別重要的基因可用敲除或修飾的方法來(lái)確定功能?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三枯氏錐蟲(chóng)——DNA復(fù)制和修復(fù)機(jī)器;布氏錐蟲(chóng)——代謝的途徑和一些細(xì)胞生物學(xué);碩大利什曼原蟲(chóng)——不尋常的基因表達(dá)等問(wèn)題；基因組都是單倍體，長(zhǎng)度從25到55Mb大小不等；多數(shù)基因都以長(zhǎng)且定向的聚集方式組合在一起，暗示主要是以多順?lè)醋拥匦问竭M(jìn)行轉(zhuǎn)錄，隨后被切割成單獨(dú)的mRNA分子?，F(xiàn)在是17頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三

在三個(gè)基因組中很少發(fā)現(xiàn)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的基因存在，但高表達(dá)一些含有RNA結(jié)合基序的蛋白質(zhì)。這些觀察結(jié)果支持了先前的觀點(diǎn)，就是錐蟲(chóng)基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。缺乏轉(zhuǎn)錄水平的精確調(diào)控帶來(lái)了一個(gè)有趣的結(jié)果：

只有通過(guò)基因的復(fù)制或擴(kuò)增來(lái)增加表達(dá)水平的提高。現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三

從DNA復(fù)制和修復(fù)的角度來(lái)看，錐蟲(chóng)類(lèi)和真核生物的其他生物區(qū)別很大。基因組不包含牽涉到應(yīng)對(duì)氧脅迫的基因；復(fù)制起始裝置更像古菌，而非真核生物（生物學(xué)和進(jìn)化學(xué)上的興趣）。錐蟲(chóng)類(lèi)特異性蛋白激酶，類(lèi)細(xì)菌的線粒體DNA聚合酶，以及特殊的表面蛋白修飾都可以作為潛在的藥物靶位點(diǎn)。

現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三

編碼基因13469個(gè),其中有首次發(fā)現(xiàn)的與血吸蟲(chóng)感染宿主密切相關(guān)的彈力蛋白酶基因。日本血吸蟲(chóng)一方面丟失了很多與營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)的基因,如脂肪酸、氨基酸、膽固醇和性激素合成基因等,這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)必須從哺乳動(dòng)物宿主獲得;另一方面,擴(kuò)充了許多有利于蛋白消化的酶類(lèi)基因家族的成員。與宿主相互作用蛋白?，F(xiàn)在是22頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三WellcomeTrustSangerInstitute原蟲(chóng)：瘧原蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、孢子蟲(chóng)…蠕蟲(chóng)：包括蛔蟲(chóng)、肝包蟲(chóng)、馬來(lái)絲蟲(chóng)，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)，管圓線蟲(chóng)…現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三

絳蟲(chóng)丟失了homeobox

基因和一些干細(xì)胞關(guān)鍵基因如piwi蛋白基因，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70和其他一些抗原基因存在種特異性擴(kuò)增。比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絳蟲(chóng)存在特異的解毒途徑，以及依賴(lài)宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝方式。確定了現(xiàn)有藥物可能的作用靶點(diǎn)，為研發(fā)高效新疫苗和新藥物提供理論支持，給有效預(yù)防和控制絳蟲(chóng)病帶來(lái)新的希望?，F(xiàn)在是27頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三第三代測(cè)序技術(shù)◆它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測(cè)10個(gè)堿基，是化學(xué)法測(cè)序的2萬(wàn)倍。◆它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。二代測(cè)序現(xiàn)在可以測(cè)到上百個(gè)堿基，但是三代測(cè)序現(xiàn)在就可以測(cè)幾千個(gè)堿基?！艟雀?，達(dá)到99.9999%。現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三二、微衛(wèi)星DNA的研究進(jìn)展及其在寄生蟲(chóng)學(xué)的應(yīng)用定義：微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA),又稱(chēng)短小串連重復(fù)序列(shorttandemrepeats,STR)或簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplerepeatssequence,SRS或SSR)。相對(duì)于衛(wèi)星序列和小衛(wèi)星序列,微衛(wèi)星的重復(fù)序列更短,一般只有1bp~6bp、長(zhǎng)度僅為幾百個(gè)bp的位點(diǎn)。微衛(wèi)星重復(fù)類(lèi)型有兩種,即單核苷酸(A/T、C/G等)和4種二核苷酸(AT/TA、AG/TC、TG/AC、CG/GC)。AC/TG約占50%以上,三、四核苷酸重復(fù)類(lèi)型和其他類(lèi)型的要少一些。

現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三優(yōu)點(diǎn)：

微衛(wèi)星DNA具有RFLP、SSLP、RAPD等遺傳標(biāo)記技術(shù)無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)☆種類(lèi)分布廣泛、高度多態(tài)性、雜合性、重組率低,☆在群體中變異范圍大、長(zhǎng)度多態(tài)性豐富、高度個(gè)體特異性、基因組中且分布比較均勻☆基因片段小、容易操作☆遵循孟德?tīng)柟诧@性遺傳規(guī)律、能提供眾多有高度遺傳信息的新的多態(tài)性標(biāo)記現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三意義：微衛(wèi)星DNA多態(tài)性標(biāo)記被應(yīng)用于動(dòng)植物遺傳育種、遺傳圖譜的構(gòu)建、群體遺傳學(xué)研究、疾病相關(guān)基因、免疫和遺傳變異機(jī)制的研究?，F(xiàn)在是31頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三寄生蟲(chóng)微衛(wèi)星DNA

寄生蟲(chóng)與宿主在進(jìn)化過(guò)程中的相互關(guān)系,為闡明寄生蟲(chóng)的進(jìn)化史提供更有價(jià)值的依據(jù);宿主對(duì)寄生蟲(chóng)免疫機(jī)制;抗藥性蟲(chóng)株的變異機(jī)制及寄生蟲(chóng)藥物的篩選;影響寄生蟲(chóng)流行和傳播的因素,這些因素如何導(dǎo)致變異等方面。

現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三三、寄生蟲(chóng)的反式剪接定義：反式剪接最早發(fā)現(xiàn)于錐蟲(chóng)(Trypanosome)可變表面糖蛋白(VSG)基因中。VSG基因轉(zhuǎn)錄后成熟mRNA5′端35bp是其基因中沒(méi)有的,這段序列來(lái)自另外一基因的小外顯子(miniexon)或SL(splicedleader),這段外來(lái)的序列與VSG的mRNA5′端接合形成成熟的mRNA。這種由來(lái)自不同基因mRNA通過(guò)剪接形成成熟mRNA的剪接方式稱(chēng)為反式剪接。SL反式剪接廣泛存在于低等真核生物中,雖然各種生物體SLRNA長(zhǎng)度,SLDNA長(zhǎng)度,SL基因拷貝數(shù)不盡相同,但SLRNA及SL反式剪接的現(xiàn)象已被廣泛證明,而且越來(lái)越多的研究者在關(guān)注和應(yīng)用這一生物現(xiàn)象?，F(xiàn)在是34頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三反式剪接與順式剪接有相似之處也有不同之處。相同的是它們中都存在典型的剪接位點(diǎn),都需要同樣的snRNP來(lái)參與?，F(xiàn)在是35頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三特點(diǎn)：SLRNA長(zhǎng)約100bp,其中有一Sm樣蛋白結(jié)合位點(diǎn),SLRNA的Sm樣蛋白結(jié)合位點(diǎn)和U6SnRNA堿基配對(duì)可在體外進(jìn)行,推測(cè)這一反應(yīng)可能吸引SLRNA于剪接體中,從而觸發(fā)了這一反式剪接的進(jìn)行。二級(jí)結(jié)構(gòu)還有兩個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。SLRNA高度甲基化形成帽子結(jié)構(gòu)。突變SLRNA失去高度甲基化形成帽子結(jié)構(gòu)的能力,會(huì)導(dǎo)致不能正常地完成反式剪接。反式剪接中至少兩步需要有SR蛋白的參與,在U2SnRNP加到3′端受體之前和之后,SR蛋白發(fā)揮重要作用。主要是通過(guò)SR蛋白的RS區(qū)磷酸化來(lái)觸發(fā)已和U2SnRNP結(jié)合的SLRNA反式剪接。現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三意義：☆應(yīng)用SL保守序列作為基因標(biāo)簽來(lái)獲得功能性基因或構(gòu)建SLcDNA文庫(kù)。SLcDNA文庫(kù)的構(gòu)建和分析可能為寄生蟲(chóng)免疫功能基因的篩選，以及研究寄生蟲(chóng)的階段特異性表達(dá)提供了更加方便、快捷的手段?，F(xiàn)在是37頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三☆

SLRNA反式剪接可作為一種重要的修復(fù)RNA外顯子突變的方法,將正常基因或具有類(lèi)似功能的基因片段連接到SL序列上,在SL的引導(dǎo)下將正常的RNA序列經(jīng)反式剪接換下突變的部分,達(dá)到修復(fù)的目的?，F(xiàn)在是38頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三☆

原核生物不存在的細(xì)胞核,沒(méi)有mRNA的后加工過(guò)程;真核生物有細(xì)胞核,轉(zhuǎn)錄初始mRNA要經(jīng)過(guò)一系列的后加工過(guò)程。而在低等真核生物中的初始mRNA經(jīng)反式剪接在5′端加上含有高度甲基化的帽子結(jié)構(gòu)(cap4)的SLRNA,似乎與典型真核生物中5′端帽化很相似,從進(jìn)化角度,這種反式剪接是一種進(jìn)化過(guò)度形式,這種形式是從原始的一共同祖先進(jìn)化而來(lái),還是不同的群體各自進(jìn)化而來(lái)還有待進(jìn)一步研究。現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三四、RNA干擾技術(shù)在人體寄生蟲(chóng)研究中的應(yīng)用進(jìn)展RNA干擾技術(shù)簡(jiǎn)介RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是一種在真核生物中普遍存在的自身防御反應(yīng),是內(nèi)源或外源性雙鏈RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)引起細(xì)胞內(nèi)有效的特異基因關(guān)閉或基因沉默現(xiàn)象。現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三1.dsRNA被RNA酶Ⅲ家族中的雙鏈RNA特異性核酸內(nèi)切酶Dicer特異性識(shí)別,隨后降解為21~23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的3′末端突出2個(gè)核苷酸的siRNA(smallinterferingRNA)。2.siRNA生成后融入一大分子多蛋白復(fù)合體——RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC),siRNA隨即解鏈為正義鏈和反義鏈。3.若目的mRNA中有部分序列與siRNA的反義鏈互補(bǔ),則siRNA的反義鏈可與之互補(bǔ)配對(duì)并將mRNA在互補(bǔ)區(qū)的中間部分降解,從而引起轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。dsRNA/siRNA介導(dǎo)途徑現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三RNAi技術(shù)的特點(diǎn)☆高穩(wěn)定性以3′端突出TT堿基的dsRNA尤為穩(wěn)定,無(wú)需象反義核酸那樣進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾以提高半衰期?！罡叨葘?zhuān)一性即dsRNA具有高度的特異性,它只能引起與dsRNA同源的基因表達(dá)活性大幅度降低,即RNAi有同源基因依賴(lài)性。siRNA除正義鏈3′端的3個(gè)堿基在序列識(shí)別中不起主要作用外,其他單個(gè)堿基改變就可能使RNAi失效,而針對(duì)同源基因共有序列的RNAi則導(dǎo)致同源基因共同失活。現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三RNAi技術(shù)的特點(diǎn)☆高效性

RNAi機(jī)制中存在催化或放大的步驟,少量的dsRNA分子就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá),能在低于反義核苷酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下研究目標(biāo)基因,比基因敲除更簡(jiǎn)單,更快捷。而且,那些在胚胎中敲除后導(dǎo)致死亡的基因,也可以利用RNAi的方法在培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行研究?！罡叽┩感?/p>

RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以穿過(guò)細(xì)胞界限,在不同細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳遞和維持,在線蟲(chóng)中干擾效應(yīng)甚至可以傳到后代去。現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三RNAi技術(shù)鑒定布氏錐蟲(chóng)基因功能現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三五、寄生蟲(chóng)MicroRNA的研究進(jìn)展定義：miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼的小RNA，在動(dòng)物中來(lái)源于長(zhǎng)度約70bp～90bp的前體。前體經(jīng)過(guò)雙鏈RNA特異性的RNaseⅢ-Drosha及RNaseⅢ-Dicer和AGO作用，最終形成18nt～22nt長(zhǎng)度的成熟，然后通過(guò)與靶mRNA3‘端非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合導(dǎo)致靶基因翻譯阻遏或者降解，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)控。

1993年在秀麗新桿線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)MicroRNA(miRNA)lin-4以及l(fā)et-7，發(fā)現(xiàn)為寄生蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究提供了新的契機(jī)?，F(xiàn)在是52頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三miRNA和siRNA之間的關(guān)系MiRNA：是非編碼的單鏈小分子RNA，在進(jìn)化上高度保守，通過(guò)翻譯抑制調(diào)控基因表達(dá)而不影響轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性；miRNAs通常是由較大的（70～90nt）的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）前體經(jīng)Dicer酶切割得到的。miRNAs則廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，從理論上推測(cè)可能參與多種調(diào)控作用。siRNA：針對(duì)編碼區(qū)的雙鏈小分子RNA，每個(gè)轉(zhuǎn)錄本都可能有很多個(gè)siRNAs，是通過(guò)降解目標(biāo)靶，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)。也要經(jīng)Dicer酶切割dsRNA得到。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中還沒(méi)有找到內(nèi)源siRNA。現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三血吸蟲(chóng)MicroRNAXue等在日本血吸蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了5種新的miRNA，其中4種具有保守性的miRNA(sja-let-7，sja-miR-71，sja-miR-125和sja-bantam)，1種(sja-miR-new1)為血吸蟲(chóng)特有。對(duì)這5種新的miRNA在日本血吸蟲(chóng)6個(gè)發(fā)育期中表達(dá)情況的分析表明，這些miRNA表現(xiàn)出高度的期特異性?！?/p>

let-7：高度的期特異性；毛蚴期非常低，而胞蚴期為毛蚴期的12倍，在尾蚴期達(dá)到高峰。因此，推測(cè)let-7在中間宿主釘螺中與毛蚴至尾蚴的發(fā)育調(diào)控相關(guān)。☆

sja-miR-71、sja-bantam：毛蚴期開(kāi)始表達(dá)，尾蚴期達(dá)到高峰。而尾蚴是血吸蟲(chóng)的感染期，當(dāng)尾蚴進(jìn)入宿主動(dòng)物細(xì)胞后，sja-miR-71的表達(dá)立刻降到最低水平然后進(jìn)入童蟲(chóng)期，并在此后的生命活動(dòng)過(guò)程中始終保持在較低的水平。sja-miR-71在尾蚴期的表達(dá)量高于童蟲(chóng)期近1000倍，sja-bantam高達(dá)500倍。表達(dá)量的變化與生活周期變化相關(guān)，與性別無(wú)關(guān)。現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)MicroRNA藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)是miRNA研究中第一個(gè)經(jīng)過(guò)克隆和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的原蟲(chóng)?，F(xiàn)在已經(jīng)明確，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的至少4種miRNA來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)的小核仁RNA(SmallnucleolarRNA，snoRNA)。起源于snoRNA的具有miRNA功能的小RNA的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了寄生原蟲(chóng)的調(diào)節(jié)性小RNA的來(lái)源。該研究首次提出miRNA來(lái)源于snoRNA，而不是由miRNA基因本身編碼，意味著在miRNA介導(dǎo)的基因沉默過(guò)程中很可能有我們尚未發(fā)現(xiàn)的新途徑。這種現(xiàn)象也意味著在寄生蟲(chóng)和宿主中起源于其它含量豐富的RNA分子(如rRNA，tRNA和snRNA)并且與AGO相關(guān)的小RNA很可能也具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三AGO蛋白在賈第鞭毛蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用，它可以特異性地與m(7)G-帽子結(jié)合，從而協(xié)助miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控。在Dicer的作用下，snoRNAGlsR17被加工為26nt大小的miRNA(miR2)。熒光素酶(Luciferase)基因在其3‘端包含6個(gè)與miR2作用位點(diǎn)一致的序列，將該酶的mRNA與人工合成的miR2共同溫育，則導(dǎo)致熒光素酶的表達(dá)量下降40%，而mRNA的穩(wěn)定性并不受影響。因此，miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控很可能是通過(guò)翻譯阻遏而不是mRNA降解完成的。另一方面，Dicer基因的沉默則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中snoRNA不能被分解，相應(yīng)miRNA在細(xì)胞中的含量急劇降低。同時(shí)變異表面糖蛋白(Variantsurfaceglycoprotein，VSG)表達(dá)不受限制，由單一表達(dá)變成多表達(dá)，表明調(diào)節(jié)藍(lán)氏賈第蟲(chóng)的抗原變異是miRNA的沉默調(diào)節(jié)功能之一。現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三六、寄生蟲(chóng)熱激蛋白的研究進(jìn)展定義：熱激蛋白（Heatshockproteins，HSPs）是指所有原核生物和真核生物在生長(zhǎng)發(fā)育或受到不同理化及病理因素刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)新合成或表達(dá)量增加的一組蛋白質(zhì)家族，屬非分泌型蛋白質(zhì)。熱激蛋白是物種種系發(fā)生中結(jié)構(gòu)和功能最為保守的一類(lèi)蛋白質(zhì)，同時(shí)也是分子伴侶（Molecularchaperone）中最重要的一類(lèi)蛋白。熱激蛋白的主要生物學(xué)功能是幫助相關(guān)蛋白質(zhì)的折疊（Folding）、移位（Translocation）、復(fù)性（Renaturation）和降解（Degradation），以保護(hù)生物體細(xì)胞免受內(nèi)外不良因素的損害。現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三作用機(jī)理：熱激蛋白通常在細(xì)胞應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生，其表達(dá)非常迅速。應(yīng)激因素包括高溫、缺氧、缺血、Ca2+含量增高、癌癥和局部損傷感染等多種有害因素，這些因素引發(fā)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，使原本在正常情況下以單體形式與阻遏蛋白結(jié)合而不能結(jié)合到熱激元件（Heatshockelement，HSE，即在熱激蛋白基因轉(zhuǎn)錄中起調(diào)控作用的DNA序列）上的熱激因子（Heatshockfactor，HSF，可識(shí)別熱激元件）受刺激而與阻遏蛋白分離，與熱激元件特異結(jié)合，從而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三寄生蟲(chóng)HSP：在寄生蟲(chóng)感染宿主過(guò)程中，宿主因寄生蟲(chóng)的入侵而處于應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生對(duì)蟲(chóng)體入侵起保護(hù)作用的HSPs。而寄生蟲(chóng)在入侵宿主的過(guò)程中，由于環(huán)境溫度和理化條件的改變，生理和免疫因素的作用，使寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體也處于應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生參與寄生蟲(chóng)分化、增強(qiáng)寄生蟲(chóng)毒力及逃避宿主免疫作用的HSPs。多數(shù)寄生蟲(chóng)的HSPs可作為免疫優(yōu)勢(shì)抗原，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體。近年來(lái)對(duì)寄生蟲(chóng)HSPs的研究熱點(diǎn)主要集中在原蟲(chóng)、線蟲(chóng)、吸蟲(chóng)等的HSP90、HSP70和HSP60上，也部分涉及sHSP。現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有68頁(yè)\編輯于星期三應(yīng)用：HSPs的許多特性顯示其具有廣闊的應(yīng)用前景，如HSP70可以作為一個(gè)潛在的亞單位疫苗佐劑協(xié)同對(duì)抗瘧原蟲(chóng)的感染。非完整片段的HSP70與完整片段的HSP70比較，兩者顯示相同的疫苗佐劑特性，將前者與瘧疾抗原EB