醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析方法

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析方法第1頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)DNA序列分析一、雙脫氧末端終止法二、化學(xué)降解法三、DNA自動化序列分析四、新一代DNA測序分析第2頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四一、雙脫氧末端終止法DNA合成反應(yīng)第3頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四ATP、dATP和ddATP的結(jié)構(gòu)第4頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第5頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四1.雙脫氧末端終止法原理DNA合成反應(yīng)中，ddNTP不存在3’-OH末端，故不能與下一個核苷酸的5’-P端形成3’,5’-磷酸二酯鍵，導(dǎo)致DNA新鏈的延伸提前終止于ddNTP.第6頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四DNA測序技術(shù)基礎(chǔ)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)能分離長度為300-500bp，差別僅1個堿基的單鏈寡核苷酸片段7第7頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPAGCT5′T4711GAATGA3′ACGCT8第8頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四2.DNA測序主要步驟

單鏈DNA模板的制備DNA模板與測序引物退火

摻入法標(biāo)記反應(yīng)（如：α-35S）

延伸-終止反應(yīng)

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

放射自顯影

閱讀測序結(jié)果第9頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第10頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四二、化學(xué)降解法

將待測DNA片段3’或5’端進(jìn)行同位素標(biāo)記，標(biāo)記的DNA片段分成四個反應(yīng)，分別用不同的化學(xué)試劑處理，造成堿基特異性切割，使DNA片段分別于某一種堿基處斷裂。第11頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第12頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP三、DNA自動化序列分析

利用雙脫氧末端終止法的原理13第13頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四用熒光化合物分別標(biāo)記4種ddNTP終止反應(yīng)產(chǎn)物，替代放射性同位素標(biāo)記是實現(xiàn)DNA測序自動化的基礎(chǔ)。第14頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四DNA自動測序步驟4種有不同熒光燃料標(biāo)記的ddNTPsSanger測序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長的熒光熒光信號采集，計算機分析與DNA自動排序第15頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四DyelabeleddideoxyterminatorsonABI3730capillaries第16頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四四、新一代DNA測序技術(shù)

基于循環(huán)芯片測序法

高通量、測序成本低

焦磷酸測序法SOLiD分析系統(tǒng)：準(zhǔn)確度最高Illumina測序儀第17頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)核酸分子雜交（NucleicAcidHybridization）一、核酸分子雜交原理二、Southern印跡雜交三、Northern印跡雜交四、斑點雜交五、原位分子雜交六、液相雜交第18頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四一、核酸分子雜交原理

指兩條互補單鏈核酸在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。

雜交雙方是探針與待測核酸序列。探針+待測核酸

雜交雙鏈第19頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四（一）印跡技術(shù)

利用各種物理方法使電泳中的生物大分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍膜、化學(xué)活化膜、濾紙等各種膜上，使之成為固化分子。（二）探針標(biāo)記技術(shù)

用放射性同位素、生物素或熒光染料標(biāo)記序列已知的多聚核苷酸鏈稱為探針。第20頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四二、Southern印跡雜交（Southern

blotting）將電泳分離的待測DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。

用于DNA定性定量分析，基因突變分析，及RFLP分析等第21頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四提取DNA限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳堿變性轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤與DNA或RNA探針雜交放射自顯影Southern印跡雜交

檢測靶分子為DNA,檢測靶分子是否含有目的基因。

預(yù)雜交第22頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四三、Northern印跡雜交（Northern

blotting）將RNA變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來鑒定其中特定mRNA分子的含量及大小。

用于mRNA定性和定量分析，即基因表達(dá)分析。第23頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第24頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四優(yōu)點：簡單、迅速可在同一張膜上進(jìn)行多個樣品的檢測核酸粗提樣品的檢測效果也較好四、斑點雜交第25頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四五、原位雜交insituhybridization用于核酸定性、定位分析。

菌落原位雜交

熒光原位雜交第26頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四核酸雜交分類表雜交方法適用范圍Southern印跡檢測經(jīng)凝膠電泳分開的DNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上Northern印跡檢測經(jīng)凝膠電泳分開的RNA分子，需轉(zhuǎn)印到膜上斑點印跡雜交檢測未經(jīng)分離的、固定在膜上的DNA或RNA分子原位雜交檢測細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子第27頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四與固相雜交的區(qū)別：直接在液體中雜交，不用純化或固定靶分子，雜交步驟更簡化，雜交速度有所提高，反應(yīng)的敏感性和特異性更強。1．核酸酶S1保護(hù)分析法

2．RNA酶保護(hù)分析法六、液相雜交技術(shù)第28頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四

利用M13噬菌體合成放射性的ssDNA探針。探針與待測RNA樣品在液相中進(jìn)行雜交，形成DNA/RNA。核酸酶S1能專一性地降解未形成雜交的DNA和RNA單鏈，不降解DNA/RNA雙鏈。

還可用于基因轉(zhuǎn)錄起始點分析、內(nèi)含子剪切位點分析。

1．核酸酶S1保護(hù)分析法（nucleaseS1protectionassay）第29頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四目的：檢測RNA，可用于mRNA的定量分析，比Northern雜交靈敏度更高。原理：探針為ssRNA，雜交后形成RNA/RNA，RNA酶A和T1專一性地降解ssRNA，而dsRNA不被降解。2．RNA酶保護(hù)分析法（RPA)第30頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第三節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（PolymeraseChainReaction，PCR）一、PCR技術(shù)原理

二、耐熱DNA聚合酶

三、PCR引物設(shè)計原則

四、PCR條件的優(yōu)化

五、PCR改進(jìn)技術(shù)第31頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):一、PCR技術(shù)原理

MullisK.

1985年發(fā)明的一種模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。

TheNobelPrizeinChemistry1993第32頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四1.PCR循環(huán)由三步組成：①變性（denaturation）：93~98℃②退火(annealing)：37~65℃③延伸(extension)：70~75℃第33頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA55555555反應(yīng)步驟示意圖第34頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。第35頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第36頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四2.PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物大小:介于兩條退火引物5′末端之間的雙鏈DNA片段。循環(huán)一第37頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四循環(huán)二第38頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四循環(huán)三一對引物：正向和反向

限制了PCR擴(kuò)增的片段的范圍第39頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四

5′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC

AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG

AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGC3′GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT

3.引物設(shè)計實例第40頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四Y=A（1+E）n

Y:擴(kuò)增產(chǎn)物的量

A:最初靶DNA分子數(shù)

E:PCR擴(kuò)增效率

n:循環(huán)次數(shù)

4.PCR產(chǎn)量

當(dāng)E＝100％,A=1時Y=2n>>2n(引物延伸產(chǎn)物的量）第41頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四PCRthermalcycler第42頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR產(chǎn)物第43頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四5.平臺期與平臺效應(yīng)PCR經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，DNA片段不再呈指數(shù)累積，而是進(jìn)入線性增長期或靜止期，即平臺效應(yīng)。影響因素：①引物及dNTP底物濃度降低。②酶與模板比例下降。第44頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四PCR平臺效應(yīng)實際應(yīng)用提示：

定量PCR應(yīng)考慮平臺期效應(yīng)，選擇最適循環(huán)次數(shù)。第45頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四二、耐熱DNA聚合酶1.TaqDNA聚合酶（實現(xiàn)了PCR自動化）●95℃的半衰期:40min●最適溫度:72℃～80℃●催化反應(yīng)速率:150～300核苷酸/秒/酶分子第46頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第47頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四TaqDNA聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；●5′→3′外切酶活性；

逆轉(zhuǎn)錄酶活性；●較弱的非模板依賴性；●缺乏3′→5′外切酶活性，無校正功能。第48頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四2.無機離子及抑制劑的影響

TaqDNA聚合酶的活性對Mg2+濃度和單價離子（K+或NH4+）的性質(zhì)和濃度較敏感。最適Mg2+濃度：2mmol/LK+濃度：50mmol/L第49頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四如何提高PCRDNA聚合酶的保真性？（1）使用TaqDNA聚合酶時，摻入少量具有3′→5′外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，錯配率可降為原來的1/10。（2）使四種dNTP底物濃度相等；（3）MgCl2濃度盡可能低；（4）減少循環(huán)數(shù)。第50頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四3.幾種高保真的耐熱DNA聚合酶TthDNA聚合酶VentDNA聚合酶PfuDNA聚合酶第51頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四三、PCR引物設(shè)計原則引物設(shè)計是決定PCR特異性擴(kuò)增的關(guān)鍵。第52頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四PCR引物設(shè)計原則：1.引物與模板的序列緊密互補2.引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)3.引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(錯配)第53頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四5′CACTGAACGTAGGCCT3′

3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′特異擴(kuò)增5′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′錯誤引發(fā)

引物與模板的序列要緊密互補引物不能在模板的非目的位點引發(fā)

DNA聚合反應(yīng)(錯配)第54頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四（1）引物之間應(yīng)避免3′端互補引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)（2）引物自身不應(yīng)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)第55頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四PCR引物設(shè)計原則:①引物長度:10～30nt②堿基分布:A、T、G、C隨機分布③G+C含量：40～60%，Tm=4(G+C)+2(A+T)④引物之間：避免3′末端互補⑤引物自身：不應(yīng)形成二級結(jié)構(gòu)⑥

引物3’末端堿基：最好選T/C/G⑦5′末端堿基：可不與模板DNA互補第56頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第57頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四模板引物TaqDNA聚合酶dNTPMg2+退火變性延伸PCR反應(yīng)體系：四、PCR條件的優(yōu)化第58頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四1.TaqDNA聚合酶濃度：

1.0～2.5U/100μl反應(yīng)液

2.dNTP濃度：20～200μmol/L

3.Mg2+濃度：0.5～2.5mmol/L4.引物濃度：0.1～0.5μmol/LPCR條件的優(yōu)化第59頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四五、PCR改進(jìn)技術(shù)反轉(zhuǎn)錄PCR

(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。第60頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四逆轉(zhuǎn)錄酶①AMV（avianmyeloblastosisvirus）酶活性最適溫度42℃②MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：最適溫度37℃第61頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四2.定量RT-PCR（QRT-PCR）半定量RT-PCR

以樣本mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在不同引物對引導(dǎo)下共同PCR擴(kuò)增“管家”基因和目的基因cDNA。第62頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四（1）選擇內(nèi)對照基因

組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和β-actinmRNA等。（2）半定量標(biāo)準(zhǔn)

計算PCR產(chǎn)物：

靶cDNA/GAPDHcDNA第63頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四（3）KPNA2在正常生理狀態(tài)東方田鼠和小鼠體內(nèi)表達(dá)分析第64頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第65頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四3.實時熒光定量PCR

（Real-timefluorescentquantitativePCR，F(xiàn)Q-PCR）PCR擴(kuò)增指數(shù)期內(nèi)極小的擴(kuò)增效率改變會極大地影響產(chǎn)量。應(yīng)用：用于基因DNA拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)定量分析。

第66頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四67（1）SYBRGreen法SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時，DNA雙鏈分開，無熒光復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號SYBRGreen第67頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第68頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四69與目標(biāo)序列互補（2）TaqMan法TaqMan水解型熒光標(biāo)記探針探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針第69頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第70頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四。（3）分子信標(biāo)探針（MolecularBeacon,TM）該探針具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5′端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)，3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。第71頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四探針與靶序列雜交結(jié)合，報告熒光染料與淬滅染料分離，發(fā)出熒光。第72頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四（4）實時熒光定量PCR計算原理PCR擴(kuò)增效率的差異使相同的樣品最終產(chǎn)量有很大差異第73頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第74頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四CT或Tc或Ct值：臨界點循環(huán)（Thresholdcycle），即從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)第75頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四第76頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四●傳染病診斷、監(jiān)測與療效預(yù)后評估：●揭示疾病發(fā)病機制第77頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四熒光定量PCR儀帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，配有電腦系統(tǒng)及分析軟件。第78頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四六、其它PCR技術(shù)1.反向PCR(inversePCR)

對已知片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。第79頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四2.Alu-PCR

利用Alu高度保守序列設(shè)計引物擴(kuò)增哺乳動物未知DNA片段的方法。

第80頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四3.原位PCR(in-situPCR)

是指直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細(xì)胞中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用特異探針進(jìn)行原位雜交檢測含該特異序列的細(xì)胞的一種方法。第81頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四4.巢式PCR（nestedPCR）

兩對引物：內(nèi)引物、外引物

可檢出低拷貝原始模板。

第82頁，共93頁，2023年，2月20日，星期四5.不對稱PCR（