原核基因表達(dá)及其調(diào)控

原核基因表達(dá)及其調(diào)控第1頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四要注意的關(guān)鍵名詞術(shù)語(yǔ):1)編碼鏈（有義鏈，thecodingstrand）;6)轉(zhuǎn)錄單位（Atranscriptionunit）;2)反義鏈（模板鏈，thetemplatestrand）;7)上游（Upstream）;3)RNA聚合酶（RNApolymerase）;8)下游（Downstream）;4)啟動(dòng)子（Apromoter）;9)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)

(Startsite);5)終止子（Aterminator）;10)初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Aprimarytranscript新生RNA序列與模板鏈互補(bǔ)；與編碼鏈相同。第2頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第3頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四RNA聚合酶可形成1個(gè)中間管道第4頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第5頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四(二)、原核生物基因的翻譯第6頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四起始因子Initiationfactors(IFs)可穩(wěn)定自由狀態(tài)的30S亞基；以及結(jié)合起始tRNA到30S-mRNA復(fù)合物上

第7頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第8頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第9頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

E.coli用作受體菌的優(yōu)勢(shì)：

（1）對(duì)其遺傳學(xué)背景、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生理學(xué)方面的了解較為深入；（2）很多目的基因能在E.coli中迅速而有效地表達(dá)；（3）其培養(yǎng)條件易于掌控，培養(yǎng)費(fèi)用相對(duì)較低。。第10頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第11頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

非調(diào)控啟動(dòng)子：對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生傷害

(1)持續(xù)性地高水平表達(dá)某一目的基因會(huì)過分消耗宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和能源，最終造成致死效應(yīng);(2)由于使宿主細(xì)胞處于生長(zhǎng)的逆境，容易發(fā)生載體質(zhì)粒的丟失；(3)非調(diào)控性地表達(dá)外源蛋白，容易受到蛋白酶的水解作用，從而使最終的蛋白量并不高；(4)形成不溶性的包含體蛋白。第12頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第13頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四可調(diào)控啟動(dòng)子的特征：

（1）通過與阻遏蛋白的相互作用，提供一個(gè)開關(guān)系統(tǒng)，使啟動(dòng)子能在特定條件下發(fā)生關(guān)閉或者開放；（2）容易被大腸桿菌的RNA聚合酶全酶所識(shí)別。第14頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四四種簡(jiǎn)單類型控制通路

誘導(dǎo)作用是指存在誘導(dǎo)物能使阻遏蛋白失活，或者可激活一個(gè)激活蛋白而解除阻遏蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄起始過程的阻遏；阻遏作用是指一個(gè)輔阻遏物激活一種阻遏蛋白，或者使一種激活蛋白失活而對(duì)轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生阻遏作用。第15頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四lac啟動(dòng)子：（1）lac啟動(dòng)子來源于大腸桿菌的乳糖操縱子，包括啟動(dòng)子、活化蛋白（cataboliteactivatorprotein,CAP）結(jié)合位點(diǎn)、操縱基因和lacZ組成。（2）lac啟動(dòng)子受到阻遏蛋白（repressor）的負(fù)調(diào)控，而受到CAP和cAMP的正調(diào)控。其中CAP的正調(diào)控是通過增加啟動(dòng)子與RNA聚合酶的親和性而起作用。(3)lac啟動(dòng)子由于與阻遏蛋白相結(jié)合而處于關(guān)閉狀態(tài)，但當(dāng)加入乳糖或者半乳糖苷結(jié)構(gòu)類似物，如異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、硫甲基半乳糖苷（TMG）和鄰硝基苯基半乳糖苷（ONTG）后可發(fā)生脫阻遏作用。第16頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四乳糖操縱子基因產(chǎn)物:1)lacI:阻遏蛋白;

2)lacZ：-半乳糖苷酶；3)lacY：透性酶;4)lacA：硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰基酶第17頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四cAMP參與乳糖操縱子的調(diào)控：（1）cAMP通過與cAMP受體蛋白（CRP）結(jié)合，引起CRP構(gòu)象變化，形成一種有活性的cAMP-CRP復(fù)合物；（2）乳糖操縱子啟動(dòng)基因（O）有2個(gè)位點(diǎn)：一個(gè)與RNA聚合酶結(jié)合；另一個(gè)與cAMP-CRP結(jié)合，而且只有后者結(jié)合后才能與啟動(dòng)基因結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程；（3）cAMP-CRP復(fù)合物不僅可以與一個(gè)啟動(dòng)基因結(jié)合，而且還可以與幾個(gè)操縱子上的啟動(dòng)基因結(jié)合，從而影響到許多操縱子。第18頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四GlucosereducesCRPactiviyCRP復(fù)合物形成促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合當(dāng)CAP與cAMP協(xié)同作用時(shí)，其對(duì)啟動(dòng)子的親和性發(fā)生增強(qiáng)，而此時(shí)如果葡萄糖的量達(dá)到最低時(shí)，其親和性最高。這樣，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，高濃度的cAMP水平能夠?qū)е氯樘遣倏v子的啟動(dòng)子發(fā)生高水平的轉(zhuǎn)錄作用。細(xì)胞中的葡萄糖濃度調(diào)控cAMP-CRP結(jié)合活性第19頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四trppromoter色氨酸啟動(dòng)子

由色氨酸阻遏蛋白進(jìn)行調(diào)控：正調(diào)控作用。可形成啟動(dòng)子-阻遏蛋白復(fù)合物。

trp啟動(dòng)子的脫阻遏可通過：

（1）移除色氨酸；（2）加入色氨酸結(jié)構(gòu)類似物，如吲哚丙烯酸（3-indoleacrylicacid）.3’--吲哚丙烯酸第20頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四trpR阻遏蛋白Trp第21頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

色氨酸操縱子（trpoperon）由啟動(dòng)子、衰減子、操縱基因和色氨酸合成的5種酶組成。

（1）由trpR產(chǎn)生的阻遏蛋白只有在與色氨酸結(jié)合后才能形成有活性的阻遏蛋白，它可以與操縱基因結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄的起始。當(dāng)色氨酸缺乏時(shí)，該阻遏蛋白的前體不能與操縱基因結(jié)合，也就不能發(fā)揮阻遏作用，此時(shí)轉(zhuǎn)錄可起始；（2）當(dāng)細(xì)胞中的色氨酸濃度較高時(shí)，在衰減子的作用下，操縱子DNA形成類似終止子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而只能翻譯出14肽，稱為前導(dǎo)肽。IAA是色氨酸的結(jié)構(gòu)競(jìng)爭(zhēng)類似物，它可以與阻遏蛋白結(jié)合而使其失去阻遏活性；不能再與操縱基因結(jié)合，從而不能阻遏轉(zhuǎn)錄過程。

第22頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第23頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四Ptac啟動(dòng)子：

是來自于lac和trp的一組雜合啟動(dòng)子，但是比lac和trp都強(qiáng)得多，是一組強(qiáng)啟動(dòng)子。包括：（1）PtacI：PlacUV5的-10區(qū)＋Ptrp的-35區(qū)；（2）PtacII：Ptrp的-35區(qū)（一段合成的包括Pribnow框在內(nèi)的46bp的DNA）＋Plac的操縱基因；（3）Ptac12：Plac的-10區(qū)＋Ptrp的-35區(qū)

所有Ptac都受IPTG的誘導(dǎo)，同時(shí)受到阻遏蛋白的阻遏調(diào)控。

第24頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四PL啟動(dòng)子：

阻遏蛋白:cI，來源于噬菌體.

cI857

:為cI溫度敏感突變體.(1)將攜帶敏感的cI857

的細(xì)菌細(xì)胞首先在28to30C條件下

培養(yǎng)，此時(shí)cI857

阻遏PL啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄；(2)當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞被培養(yǎng)至特定濃度時(shí)（一般是到達(dá)平衡期），將培養(yǎng)溫度升高至42C,此時(shí)cI857

不再發(fā)生阻遏作用，PL啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程。

第25頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

PL為噬菌體左向早期啟動(dòng)子，控制基因從N到att的早期轉(zhuǎn)錄，受到cI所編碼的阻遏蛋白的調(diào)控。噬菌體左向操縱子結(jié)構(gòu)示意圖PL啟動(dòng)子第26頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第27頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四優(yōu)良表達(dá)載體的性能（1）強(qiáng)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子；（2）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的強(qiáng)弱；（3）質(zhì)粒載體及其質(zhì)粒的拷貝數(shù)；是否整合到染色體DNA之上；（4）合成的外源蛋白在細(xì)胞中的定位；（5）宿主的翻譯效率；（6）克隆載體所表達(dá)的外源蛋白的穩(wěn)定性。第28頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

1、含lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體：

多種。其最大的特點(diǎn)是帶有編碼lacZ（-半乳糖苷酶）的編碼序列。當(dāng)外源基因插入后，如果能夠保持正確的ORF，就可以形成由外源基因編碼的多肽和-半乳糖苷酶組成的融合蛋白。所有含lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體都受到IPTG的誘導(dǎo)。第29頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

pOP203-13特點(diǎn)（1）為pBR322衍生質(zhì)粒，插入了強(qiáng)啟動(dòng)子PlacUV5并在其下游加入了-半乳糖苷酶的編碼序列（-gal）21bp片斷和一個(gè)EcoRI位點(diǎn)；（2）其融合蛋白的N端為-半乳糖苷酶的前7個(gè)氨基酸和

EcoRI接頭編碼的少數(shù)幾個(gè)氨基酸，其C端為完整的外源蛋白。pOP203系列表達(dá)載體：AfamilyofcloningvectorscontainingthelacUV5PromoterpOP203-1,2,3、pOP203-13、pOP203-24、pOP203-27、pOP203-28、pOP203-29表達(dá)載體pOP203質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖第30頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

2、含trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體：（1）產(chǎn)生的表達(dá)蛋白的量高于lac啟動(dòng)子；（2）所有含trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體都受到3--吲哚丙烯酸（IAA）的誘導(dǎo)。如：pDR720第31頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

質(zhì)粒pDR720是一個(gè)含trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體，它來源于p51，trp啟動(dòng)子在SmaI位點(diǎn)插入，在啟動(dòng)子的下游有3個(gè)位點(diǎn)，SalI、BamHI和SmaI，可以插入外源基因。質(zhì)粒載體pDR720結(jié)構(gòu)示意圖第32頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

3、含tac啟動(dòng)子的表達(dá)載體：

高表達(dá)效率啟動(dòng)子；受IPTG的誘導(dǎo)。多種商業(yè)化的載體。如：pKK223-3;pBADHis-A,B,C;pTrcHis-A,B,C;pSE420

第33頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四特點(diǎn)：1）Ampr；2）tac啟動(dòng)子；3）lacZ核糖體結(jié)合部位；4）ATG起始密碼子，位于RBS下游8bp處；5）來源于-噬菌體的終止子T1和T2，以避免其它基因的過度轉(zhuǎn)錄。第34頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第35頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第36頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第37頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

4、含PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體：是一種極強(qiáng)的啟動(dòng)子，所以被廣泛用于各種載體的構(gòu)建；如：pPL-;（1）來源于pBR322,pBR322的EcoRI/BamHI位點(diǎn)被PL和N基因取代；（2）外源基因可以插入到N基因中的HpaI位點(diǎn)；（3）當(dāng)培養(yǎng)溫度為29-31C時(shí)，PL啟動(dòng)子處于阻遏狀態(tài)；但當(dāng)溫度升到42C，發(fā)生脫阻遏。第38頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四質(zhì)粒載體pPL-結(jié)構(gòu)示意圖第39頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（三）提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量某些表達(dá)載體被構(gòu)建用于增加蛋白質(zhì)的表達(dá)量，例如，pPLc2833

:（1）強(qiáng)啟動(dòng)子；（2）選擇性標(biāo)記；（3）多克隆位點(diǎn)（MCS）其衍生質(zhì)粒pCP3的構(gòu)建：將pPLc2833的復(fù)制起始位點(diǎn)替換為另一個(gè)質(zhì)粒pKN402。質(zhì)粒pKN402的復(fù)制起始位點(diǎn)是耐溫型的，在42C時(shí)仍然有很強(qiáng)的復(fù)制起始的功能。第40頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四電泳后回收片段c電泳后回收片段1和3連接第41頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

由于pKN402和pCP3的復(fù)制子在42C時(shí)仍然具有很強(qiáng)的起始復(fù)制能力，因此當(dāng)培養(yǎng)溫度升高到42C時(shí)，細(xì)胞中的pKN402和pCP3的拷貝數(shù)要比pPLc2833高5～10倍。溫度對(duì)3種表達(dá)載體質(zhì)?？截悢?shù)的影響第42頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（四）大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)

小規(guī)模培養(yǎng)（1～5L）含表達(dá)載體的重組菌株時(shí)，其調(diào)控可以直接向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物，或者升高溫度，但是在半工業(yè)化（20～200L）或者工業(yè)化大規(guī)模（大于200L）生產(chǎn)時(shí)，不能采用小規(guī)模的方法：（1）直接向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物如IPTG，由于需要量較大，成本高，不經(jīng)濟(jì)；（2）即使是使用溫度敏感的表達(dá)載體，升高溫度既需要較長(zhǎng)的時(shí)間，又需要很大的能源消耗，成本也很高。一種解決的途徑：使用“雙質(zhì)粒系統(tǒng)”：用trp啟動(dòng)子帶動(dòng)編碼cI阻遏蛋白的基因，然后將它們置于一個(gè)弱啟動(dòng)子的載體上；將要表達(dá)的外源基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子PL之下，使其受PL啟動(dòng)子的控制。第43頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四“雙載體系統(tǒng)”特點(diǎn)：1）當(dāng)培養(yǎng)基中Trp含量較低時(shí)，trp啟動(dòng)子啟動(dòng)，cI阻遏蛋白合成，此時(shí)PL啟動(dòng)子受阻遏，目的基因不表達(dá)；2）添加Trp（可添加蛋白胨）以后，trp啟動(dòng)子受阻遏，而PL啟動(dòng)子啟動(dòng)，此時(shí)可表達(dá)外源蛋白。A培養(yǎng)基中不存在色氨酸B培養(yǎng)基中存在色氨酸cI蛋白合成（脫阻遏）無克隆基因蛋白合成（阻遏）克隆基因蛋白合成（脫阻遏）cI蛋白不合成（阻遏）第44頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（五）在其它微生物中的表達(dá)

除了E.coli以外，有些微生物也可以用作表達(dá)外源蛋白的宿主菌（受體菌）。

-半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達(dá)：

苜蓿根瘤菌豌豆根瘤菌惡臭假單胞菌大腸桿菌第45頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

-半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達(dá)分析：(1)所有啟動(dòng)子在受體菌中都有一定的活性；(2)tac啟動(dòng)子在大腸桿菌中活性最高，但是在其它受體菌中活性最低；(3)新霉素基因啟動(dòng)子（Nm）是在大腸桿菌中活性最低的啟動(dòng)子，但是在其它受體菌中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性卻最高。第46頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第47頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

該載體含有四環(huán)素抗性基因(Tetr),1個(gè)BglII酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒復(fù)制子，啟動(dòng)子和1個(gè)多克隆位點(diǎn)（amultiplecloningsequence，MCS)。廣宿主載體第48頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（六）非融合蛋白的表達(dá)

指所表達(dá)的外源蛋白的N-末端不含有其它任何氨基酸，因此要求其翻譯起始位點(diǎn)ATG必須要位于其基因的5’端。表達(dá)非融合蛋白，一般要求其編碼基因的ATG起始位點(diǎn)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）之間的距離要合適，否則即使僅相差2~3個(gè)bp，表達(dá)效率也會(huì)大受影響。RBS－ATG最適距離的篩選：（1）在ATG上游約100bp處尋找1個(gè)酶切位點(diǎn)，進(jìn)行酶切；（2）再用核酸外切酶III（ExoIII）從該酶切位點(diǎn)開始，部分消化以上酶切片斷，得到不同長(zhǎng)度的消化片斷；（3）將各消化片斷與含有啟動(dòng)子序列和RBS序列的載體連接，構(gòu)建成系列可表達(dá)的重組基因，導(dǎo)入受體菌進(jìn)行表達(dá)量分析，從中篩選到最適的RBS-ATG距離。（4）構(gòu)建融合蛋白。

第49頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第50頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

表達(dá)非融合蛋白的優(yōu)勢(shì)：

單基因產(chǎn)物，不受其它蛋白質(zhì)成分的干擾，有利于其展現(xiàn)完整功能和保持活性。

不利方面：容易受到受體菌蛋白酶的降解，產(chǎn)量較低。

克服的方法：（1）用蛋白酶活性低的菌株作為受體菌。如枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）蛋白酶活性強(qiáng)，而且具有外分泌性，但短芽孢桿菌（Bacillusbrevis）的蛋白酶活性就低得多；（2）用黃嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株（Ion－）作為受體菌。Ion為E.coli合成蛋白酶的主要底物。（3）用蛋白酶抑制劑。如T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物?？梢詫in同時(shí)克隆到質(zhì)粒載體上。第51頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（七）融合蛋白的表達(dá)及純化

指所表達(dá)的外源蛋白與一種宿主蛋白共價(jià)連接，構(gòu)成融合蛋白。

1、融合蛋白的表達(dá)1.“三夾板”式融合2.3.C-末端融合N-末端融合運(yùn)載蛋白運(yùn)載蛋白異源功能蛋白運(yùn)載蛋白運(yùn)載蛋白異源功能蛋白異源功能蛋白第52頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四通過在細(xì)胞膜跨膜蛋白中“鑲嵌”外源蛋白，是一種典型的“三夾板”式融合方式第53頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

pPC系列載體：pPC?Z1，pPC?Z2和pPC?Z3。彼此相差一個(gè)堿基。

第54頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四1、pPC載體組中每一個(gè)載體

lacZ啟動(dòng)子、SD序列和lacZ

基因的前8個(gè)氨基酸編碼序列，在lacZ的下游有1個(gè)

EcoRI位點(diǎn)；2、pPC?Z1的EcoRI位點(diǎn)保持不變，其末端為-G;3、pPC?Z2的EcoRI位點(diǎn)之前多了2個(gè)G，經(jīng)EcoRI酶切后的為-GGG；4、pPC?Z3的EcoRI位點(diǎn)之前多了4個(gè)G，經(jīng)EcoRI酶切后的為-GGGGG。第55頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第56頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

2、融合蛋白的純化將融合蛋白分割成宿主蛋白和外源蛋白的策略：（1）在融合蛋白和宿主蛋白之間加入一段可被蛋白酶識(shí)別的氨基酸序列，如Ile-Glu-Gly-Arg可被溶血因子X識(shí)別并在C端切開，并且這一段序列在自然狀態(tài)下很少出現(xiàn)，因此可以用于分割融合蛋白；

第57頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

（2）在胰島素中沒有Met，因此在基因工程胰島素和宿主蛋白之間可以加入一個(gè)Met，而表達(dá)的融合蛋白的Met在體外可以被CNBr轉(zhuǎn)移性識(shí)別和切割，從而形成2條多肽鏈，1條是胰島素，另1條是宿主多肽。經(jīng)過進(jìn)一步的提純，就可以得到完整的胰島素。第58頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3、融合蛋白的應(yīng)用（1）在大多數(shù)情況下，融合蛋白本身就是很好的終產(chǎn)物，無需處理，如可以用融合蛋白來制備抗體；（2）由于融合蛋白的某些功能單元，可以用于簡(jiǎn)化提純步驟?，F(xiàn)已開發(fā)大量的表達(dá)融合蛋白的商業(yè)性載體：如Invitrogen公司：細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)：pBADHis系列、pTrcHis系列等，酵母菌表達(dá)系統(tǒng)：pPIC3.5K、pPIC9K等多種。第59頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第60頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第61頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第62頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（八）單一方向串連排列的基因

在低拷貝質(zhì)粒中表達(dá)多個(gè)串連排列的基因，以增加蛋白的表達(dá)量。限制性內(nèi)切酶AvaI的應(yīng)用：表達(dá)多個(gè)串連基因的表達(dá)載體的構(gòu)建

AvaI第63頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

單一方向串連排列基因構(gòu)建方法：（1）先把含CTCGGG序列的質(zhì)粒用AvaI切開，用DNA聚合酶I補(bǔ)平，兩端與EcoRI接頭連接，外源基因的起始和終止子都可以通過EcoRI位點(diǎn)克隆到載體上；（2）然后把這個(gè)重組片斷再用AvaI切出，切出的DNA片斷兩端的粘性末端不同，因此連接時(shí)只能有一個(gè)方向；（3）由于插入外源基因使用的是單一的EcoRI位點(diǎn)，因此基因插入的方向有2個(gè)，其中只能有一個(gè)能夠表達(dá)。第64頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第65頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（九）增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

構(gòu)建和表達(dá)長(zhǎng)半衰期的外源蛋白。正常情況下蛋白質(zhì)的半衰期：從幾分鐘到幾小時(shí)不等。決定于：（1）二硫鍵形成情況。二硫鍵可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的半衰期；（2）所表達(dá)的蛋白質(zhì)的N端是否有特定的氨基酸。一般可以通過在N端增加1個(gè)或幾個(gè)氨基酸，來使蛋白質(zhì)的半衰期延長(zhǎng)。如：在-半乳糖苷酶的N端加上不同的氨基酸，體外存活的時(shí)間可以從2分鐘到20小時(shí)不等。（3）在可能的情況下，改變蛋白質(zhì)中的“PEST”序列，但這種改變不能影響蛋白質(zhì)的功能。

PEST序列：即存在于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的Pro（P）、Glu（E）、Ser（S）和Thr（T），由于在它們的兩端往往存在帶正電的氨基酸殘基，極易受到蛋白酶的攻擊。

第66頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第67頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（十）將外源基因整合入染色體上

（1）相對(duì)穩(wěn)定地存在，沒有選擇壓力時(shí)也可長(zhǎng)期保存；（2）外源基因的整合位點(diǎn)不能位于對(duì)宿主菌特別重要的基因內(nèi)部；（3）一般整合到染色體上的目的基因最好也是由可調(diào)控的啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控。外源基因的整合途徑：（1）轉(zhuǎn)座作用（包括插入序列）；（2）同源交換。

第68頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四A、雙交換的發(fā)生：僅目的基因整合到染色體上B、單交換：整個(gè)質(zhì)粒整合到染色體上第69頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四使用Marker可以很方便地篩選整合重組菌株第70頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四-淀粉酶基因整合到染色體上的拷貝數(shù)與未發(fā)生整合但由多拷貝質(zhì)粒攜帶時(shí)表達(dá)活性的比較第71頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第72頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（十一）外源蛋白的分泌分泌途徑：（1）分泌到周質(zhì)區(qū)（周質(zhì)空間）；（2）完全分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。大腸桿菌蛋白的途徑：（1）N端有分泌信號(hào)的蛋白：信號(hào)肽以及一組以Sec命名的蛋白：SecA、B、D、E、F和Y等，一般僅分泌到周質(zhì)空間。（2）C端有分泌信號(hào)的蛋白：-溶血素（-hemolysin）:可完全分泌到培養(yǎng)基中。第73頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第74頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第75頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四第76頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四（一）包含體蛋白的提取包含體蛋白：Inclusionbody在大腸桿菌中當(dāng)外源蛋白的表達(dá)量達(dá)到20％時(shí)，由于表達(dá)部位的低電勢(shì)和外源蛋白分子的特殊結(jié)構(gòu)（如富含Cys、無糖基化等），使外源蛋白與其周圍的其它雜蛋白及其核酸一起形成的一種不溶性的結(jié)構(gòu)。在大腸桿菌中所表達(dá)的外援蛋白大部分都是以包含體的形式存在。第二節(jié)原核生物表達(dá)產(chǎn)物的分離純化第77頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四

包含體蛋白的提取步驟：

（1）菌體的收獲、破碎與包含體的洗滌一般可在5000～10000g下離心收集菌體，然后進(jìn)行菌體的破碎。菌體常用破碎方法：①物理方法：Sonication/FrenchPressure②化學(xué)方法：Lysozyme（溶菌酶）、表面活性劑、強(qiáng)堿（須考慮外源蛋白的耐受性）洗滌目的：去除吸附在包含體表面的不溶性雜蛋白。常用洗滌液：①1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、NP40等；②可以在中性去垢劑中再添加EDTA和二硫蘇糖醇（DTT）、巰基乙醇等還原劑，并保持NaCl的濃度為50mM；③低濃度鹽酸胍或中性去垢劑、EDTA及還原劑共同使用。加入的洗滌液可以通過柱層析等方法除去。

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包含體蛋白的提取步驟：

（1）菌體的收獲、破碎與包含體的洗滌一般可在5000～10000g下離心收集菌體，然后進(jìn)行菌體的破碎。菌體常用破碎方法：①物理方法：Sonication/FrenchPressure②化學(xué)方法：Lysozyme（溶菌酶）、表面活性劑、強(qiáng)堿（須考慮外源蛋白的耐受性）洗滌目的：去除吸附在包含體表面的不溶性雜蛋白。常用洗滌液：①1%以下的中性去垢劑，如Tween、Triton、NP40等；②可以在中性去垢劑中再添加EDTA和二硫蘇糖醇（DTT）、巰基乙醇等還原劑，并保持NaCl的濃度為50mM；③低濃度鹽酸胍或中性去垢劑、EDTA及還原劑共同使用。加入的洗滌液可以通過柱層析等方法除去。

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（2）包含體的融解包含體是通過疏水作用力、氫鍵、離子鍵和二硫鍵等維持的，融解時(shí)必須綜合考慮變性劑的濃度、溫度、作用時(shí)間、溶液離子強(qiáng)度、pH值及其蛋白質(zhì)濃度與變性劑的比值等多種復(fù)雜因素。①SDS：是曾經(jīng)廣泛使用的溶解劑，可以在低濃度（1％）下使包含體溶解。但是結(jié)合到外源蛋白上的SDS分子很難除去，這種蛋白作為藥物使用的話，可能會(huì)造成流產(chǎn)；同時(shí)少量氧化物的存在會(huì)造成外源蛋白的共價(jià)修飾，因此目前很多國(guó)家的政府機(jī)構(gòu)，已經(jīng)禁止用SDS溶解的蛋白產(chǎn)品上市。②尿素和鹽酸胍：對(duì)包含體的氫鍵有較強(qiáng)的可逆變性作用。一般人們采用8～10mol/L的尿素溶解包含體，其溶解速度較慢，溶解度為70－90％。在復(fù)性后不會(huì)造成蛋白質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)還可以選用多種層析方法對(duì)提取到的包含體進(jìn)行純化。目前，尿素已被廣泛用于包含體的溶解。第80頁(yè)，共86頁(yè)，2023年，2月20日，星期四鹽酸胍的溶解效率很高，可以達(dá)到95％以上，且溶解速度快，因而不會(huì)對(duì)外源蛋白進(jìn)行共價(jià)修飾。但是，它的缺點(diǎn)就是成本較高，而且除去鹽酸胍會(huì)造成較大的蛋白質(zhì)損失，另外，鹽酸胍對(duì)于外源蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的離子交換層析有干擾作用。。一般變性時(shí)要考慮以下幾方面的因素：

①變性劑的濃度及變化率；②外源蛋白的濃度及其純度；③氧化還原劑的選擇；④