簡易菌種采集繁育方法

隨著社會的迅猛發(fā)展，科技的不斷創(chuàng)新，小小的微生物受到了高度的重視，就如杠桿的支點(diǎn)，起著舉足輕重的作用。微生物蘊(yùn)藏著無限的商機(jī)。植物組織培養(yǎng)擴(kuò)繁制藥金線蓮保健品、微生物發(fā)酵工程釀酒做飲品、微生物飼料發(fā)酵劑發(fā)酵飼料養(yǎng)豬、微生物肥料發(fā)酵劑發(fā)酵園林廢棄物作有機(jī)肥、微生物做菌種原種栽培種種植杏鮑菇等等，這些都蘊(yùn)藏著無限的商機(jī)，造就了成千上萬的企業(yè)，解決了許多高校大學(xué)生以及社會人士的就業(yè)。然而，菌種的制作過程是比較復(fù)雜的，需要經(jīng)過將樣品的土著微生物在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)過涂布法篩選等分離單一菌株（計(jì)數(shù)、提純、復(fù)壯、種子培養(yǎng)、擴(kuò)大培養(yǎng)（種子罐X各菌種按一定比例混合等一系列過程。農(nóng)戶、種植戶等可以通過簡易的方法采集繁育原種、一級種就可以節(jié)省成本，而且簡單易行。1：土著菌采集方法土著菌的概念：土著菌就生活在我們周圍的自然環(huán)境中，走進(jìn)闊葉樹林或竹林，在落葉且腐殖質(zhì)多地方，扒開樹葉或雜草就可以看到細(xì)絲壯白色菌落（沒有雜菌污染的），這就是有益的土著微生物。土著微生物是多種有益微生物的混合群，土著微生物按好嫌氣性分有好氣菌、嫌氣菌;按菌種分有酵母菌、曲霉菌、放線菌、乳酸菌、芽抱菌等?？梢栽诓煌募竟?jié)、不同的地點(diǎn)采集不同的菌種。采集到的原始菌種應(yīng)放在室內(nèi)陰涼、干燥處保存。土著菌采集方法：1、采集方法有三種：1） 水田土著微生物采集方法在剛收割后的水稻、玉米、高粱或大豆秸稈上有白色液體溢出。把裝好米飯并蓋宣紙的木箱倒扣在秸稈上，讓秸稈茬穿透宣紙接觸米飯，約7天后，木箱的米飯變成粉紅色稀泥狀態(tài)，同①方法，米飯與紅糖以2：1比例拌勻裝壇子、蓋宣紙、系繩。5-7后內(nèi)容物變成原液（原原種）。2） 林蔭落葉區(qū)采集法在受人類活動影響較小的山上和溝谷喬木、灌木及竹林落葉豐富且腐殖質(zhì)較多的地方，挖一個30厘米的坑。把做的稍微有一點(diǎn)硬約八成熟的大米飯裝入瓷碗中，米飯高7厘米；用宣紙封好，用繩子系好口，置于坑內(nèi)（也有用干凈杉木板做的小木箱（25cmX20cmX10cm）約三分之一，大米飯上面蓋上宣紙，封好口），用樹葉和腐殖質(zhì)土將其埋好。為防止野生動物糟蹋，最好罩上鐵絲網(wǎng)和遮雨用的塑料膜。夏季經(jīng)3-5天，春秋經(jīng)6-7天，周邊的土著微生物潛入到米飯中，溫度18。。左右大約放置7天左右在米飯上形成白色菌落（放置時間稍長時會形成各種顏色菌落，雖然也能利用，但最

好還是用白色菌落；如發(fā)現(xiàn)有黑色的菌落，則表明有雜菌侵入，需要重新制作）。米飯就會變成液體狀態(tài)，飯粒多少會有些殘留，但不礙事。將米飯與紅糖以：1比例拌勻裝壇子、蓋宣紙、系繩。放在18。的陰涼處，5-7后內(nèi)容物變成稀泥狀原液，這就是土著微生物菌種（原原種）。2、提純復(fù)壯：以下步驟適用于菌種生產(chǎn)單位實(shí)驗(yàn)室!普通用戶可以不做!有條件的可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。一般情況下，采來的樣品可以直接進(jìn)行分離，但是如果樣品中我們所需要的菌類含量并不很多，而另一些微生物卻大量存在。此時，為了容易分離到所需要的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，即設(shè)法增加所要菌種的數(shù)量，以增加分離的幾率?？梢酝ㄟ^選擇性的配制培養(yǎng)基（如營養(yǎng)成分、添加抑制劑等），選擇一定的培養(yǎng)條件（如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基酸堿度等）來控制。具體方法是根據(jù)微生物利用碳源的特點(diǎn)，可選定糖、淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其他微生物就可能死亡或淘汰。對G-菌（G-桿菌是指革蘭氏陰性桿菌，G+桿菌，是革蘭氏陽性桿菌。是一種細(xì)菌染色方法。如果檢查結(jié)果是加號，說明有感染。如果是減號就沒啥。）有選擇的培養(yǎng)基（如結(jié)晶紫營養(yǎng)培養(yǎng)基、紅一紫膽汁瓊脂、煌綠膽汁瓊脂等）通常含有5%-10%的天然提取物。在分離細(xì)菌時，培養(yǎng)基中添加濃度一般為50Mg/ml的抗真菌劑（如放線菌酮和制霉素），可以抑制真菌的生長。在分離放線菌時，通常于培養(yǎng)基中加入1-5ml天然浸出汁（植物、巖石、有機(jī)混合腐質(zhì)等的浸出汁）作為最初分離的促進(jìn)因子，由此可以分離出更多不同類型的放線菌類型；放線菌還可以十分有效地利用低濃度的底物和復(fù)雜底物（如幾丁質(zhì)）。因此，大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的，而不是在含豐富營養(yǎng)的生長培養(yǎng)基上分離的;在放線菌分離瓊脂中通常加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。此外，為了對某些特殊種類的放線菌進(jìn)行富集和分離，可選擇性地添加一些抗生素（如新生霉素）。在分離真菌時，利用低C/N比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計(jì)數(shù)、分離和簽定；在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素如氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素等即可有效地抑制細(xì)菌生長及其菌落形成。抑制細(xì)菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，將平皿先干燥3-4天；降低培養(yǎng)基的pH值或在無法降低pH時，加入1：30000玫瑰紅。這樣有利于下階段的純種分離。通過增殖培養(yǎng)，樣品中的微生物還是處于混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這一步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且要控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。同時必須進(jìn)行純種分離，常用的分離方法有稀釋分離法、劃線分離法和組織分離法。稀釋分離法的基本方法是將樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后將稀釋液涂布于培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，待長出獨(dú)立的單個菌落，進(jìn)行挑選分離。劃線分離法要首先倒培養(yǎng)基平板，然后用接種針（接種環(huán)）挑取樣品，在平板上劃線。

劃線方法可用分步劃線法或一次劃線法，無論用哪種方法，基本原則是確保培養(yǎng)出單個菌落。組織分離法主要用于食用菌菌種或某些植物病原菌的分離。分離時，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液對植物或器官組織進(jìn)行表面消毒，用無菌水洗滌數(shù)次后，移植到培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天后，可見微生物向組織塊周圍擴(kuò)展生長。經(jīng)菌落特征和細(xì)胞特征觀察確認(rèn)后，即可由菌落邊緣挑取部分菌種進(jìn)行移接斜面培養(yǎng)。對于有些微生物如毛霉、根霉等在分離時，由于其菌絲的蔓延性，極易生長成片，很難挑取單菌落。常在培養(yǎng)基中添加0.1%的去氧膽酸鈉或在察氏培養(yǎng)基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于單菌落的分離。經(jīng)過分離培養(yǎng)，在平板上出現(xiàn)很多單個菌落，通過菌落形態(tài)觀察，選出所需菌落，然后取菌落的一半進(jìn)行菌種鑒定，對于符合目的菌特性的菌落，可將之轉(zhuǎn)移到試管斜面純培養(yǎng)。這種從自然界中分離得到的純種稱為野生型菌株，它只是篩選的第一步，所得菌種是否具有生產(chǎn)上的實(shí)用價值，能否作為生產(chǎn)菌株，還必須采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。如果此野生型菌株產(chǎn)量偏低，達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，可以留之作為菌種選育的出發(fā)菌株?；钚院玫耐林梢杂糜扇斯づ囵B(yǎng)、擴(kuò)陪成純度高的微生物菌群！土著菌發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)、養(yǎng)