大腸桿菌基因組DNA的提取及熒光定量PCR試驗(yàn)設(shè)計(jì)

與蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白質(zhì),再用酚與氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì),得到得DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。價(jià)鍵受到破壞,失去二級(jí)結(jié)構(gòu),從而變形失活,蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為光譜蛋白酶,其重要特性就是能在SDS與EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)存在得情況下氨基酸,使DNA分子完整地分離出來(lái)、用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白質(zhì),最后用無(wú)水乙醇沉淀DNA。為獲得高純度DNA,操作過(guò)程中常加入RNaseA除去RN形成復(fù)合物,在高鹽溶液中(0。7mol／LNaCl)就是可溶得,當(dāng)降低溶液鹽濃度molLNaCl過(guò)離心就可將CTAB-核蛋白,多糖物質(zhì)分開。最后通過(guò)乙醇或異丙醇沉淀DNA,而CTAB1)實(shí)驗(yàn)材料:大腸桿菌1)LB液體培養(yǎng)基:細(xì)菌培養(yǎng)用膠化蛋白胨10g/L,細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5(攪拌溶解后,用5mol/LNaOH調(diào)pH至7、0.用去離子水定容100ml,用20/2)TE緩沖液:1Mtris-HClpH8、0溶液(取1MTris溶液160ml用分析純鹽酸調(diào)至Ph=8.0(需濃鹽酸約8。5ml),加ddH2O定容至200ml,高壓滅菌備用)TE緩沖液(10mMTris-HCl1MmEDTApH=8。0,1MTris—HClB0、5MEDTAPH=8。01ml向燒杯中加入約400mlddH2O均勻混合;將溶液定容到500ml后,高溫高壓滅菌,室溫保存)3)蛋白酶K:(20mg蛋白酶K溶于1ml無(wú)菌雙蒸水,－20℃?zhèn)溆?4)CTAB/NaCl溶液:(5％w/v,5gCTAB溶于100ml0、5MNaCl溶液中,需加行二級(jí)培養(yǎng),培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(4—6h)。2、取菌液1。5ml置于離心管中,以5000rpm冷凍離心1min,棄上清液4、加入1ul蛋白酶K(20mg／ml),混勻,37℃保溫1小時(shí)、5、加30ul5mol/LNaCl,混勻。6、加30ulCTAB/NaCl溶液,混勻,65℃保溫20min8、取上清液,加入300ul氯仿/異戊醇(24:1)抽提,5000rmp離心10minDNA,5000rmp離心10min10、加500ul70％乙醇洗沉淀,5000rmp離心10min二、試劑盒法提取大腸桿菌基因組DNA。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒:1、TGuide細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302-0250次420元2、TaKaRa細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒TaKaRaDV810A50650元3、Biomiga細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒GD2411－01BacterialgDNAkit50次423元GD2411—02BacterialgDNAkit250次1798元4、Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒BSC12M1100次750元5、OMEGA細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DEZNA。TMBacterialDNAkit2003350元定量實(shí)驗(yàn)就是一種實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn),用于在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)得每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)期間測(cè)定靶核苷酸序列(靶)數(shù)量、其中靶可以就是DNA、cDNA或RNA?！緦?shí)驗(yàn)原理】在實(shí)時(shí)定量實(shí)驗(yàn)中,反應(yīng)就是在PCR產(chǎn)物得擴(kuò)增達(dá)到固定熒光水平時(shí)得循環(huán)期間時(shí)間點(diǎn)來(lái)描述得,而不就是在固定循環(huán)次數(shù)后累積得PCR產(chǎn)物最終數(shù)量來(lái)描述。擴(kuò)增曲線以圖形形式顯示在執(zhí)行得循環(huán)次數(shù)中檢測(cè)到得熒光。?在PCR得最初幾次循環(huán)中,熒光信號(hào)沒有明顯變化。該預(yù)定義得PCR循環(huán)范圍稱度(與基線循環(huán)相對(duì)應(yīng)得Rn值)得數(shù)學(xué)趨勢(shì),生成一個(gè)基線簡(jiǎn)化擴(kuò)增曲線。然后,算法將搜索擴(kuò)增曲線上基線校準(zhǔn)后歸一化報(bào)告熒光信號(hào)強(qiáng)度(deltaRn[?Rn]值)與閾值交叉得點(diǎn)。?Rn值與閾值交叉得分?jǐn)?shù)循環(huán)定義為CT。1、定義實(shí)驗(yàn)屬性后選擇要設(shè)計(jì)得實(shí)驗(yàn)類型。1)ExperimentName(實(shí)驗(yàn)名稱)、2)Barcode(條碼),然后輸入您得PCR反應(yīng)板上得條碼。(可不填)3)UserName(用戶名)。選擇Quantitation(定量)實(shí)驗(yàn)類型2、定義方法與材料在Methods＆Materials(方法與材料)屏幕上,選擇用于實(shí)驗(yàn)得將StandardCurve(標(biāo)準(zhǔn)曲線)選為定量方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)確定樣板對(duì)照(NTC)”。陰性對(duì)照應(yīng)不會(huì)擴(kuò)增。2)為試劑選擇TaqMan?Reagents(TaqMan試劑)(包括兩個(gè)引物一–如果使用TaqMan試劑以檢測(cè)擴(kuò)增并定量樣本中靶得數(shù)量,則選擇在擴(kuò)增靶時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。切記！AppliedBiosystems不建議將TAMRATM染料隨–如果使用SYBRGreen試劑以檢測(cè)擴(kuò)增并定量樣本中靶得數(shù)量,則選SYBRGreenReagentsSYBRGreenSYBRGreen試劑包括兩可在結(jié)合到雙鏈DNA時(shí)產(chǎn)生熒光信號(hào)。SYBRGreen染料通常就是添加到反應(yīng)得e將Standard(標(biāo)準(zhǔn))選為升降溫速度。AppliedBiosystems不提供SYBRGreen試劑得Fast母液。3)為升降溫速度選擇Standard(~2hourstopletearun)–如果為PCR反應(yīng)使用Fast試劑,則選擇Fast(~40Minutesto?CompleteaRun)(快速(約40分鐘完成運(yùn)行))、試劑),則選擇Standard(~2HourstopleteaRun)(標(biāo)準(zhǔn)(約2小時(shí)4)為模板類型選擇gDNA(genomicDNA)(gDNA(基因組DNA))。5)Next>(下一步)。在Targets(靶)屏幕上,輸入您想在PCR反應(yīng)板中定量得靶數(shù)量,然后1)單擊Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinther將以您輸入得數(shù)字更新。s建議反應(yīng)板中得每個(gè)靶檢測(cè)設(shè)置一條標(biāo)準(zhǔn)曲線、注意:SetUpStandards(設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品)復(fù)選框默認(rèn)情況下已選取。–如果要將FAMTM染料加在您用于檢測(cè)靶得TaqMan探針得5′端,則–如果要將JOETM染料加在您用于檢測(cè)靶得TaqMan探針得5′端,–如果要將VIC?染料加在您用于檢測(cè)靶得TaqMan探針得5′端,則選擇VIC、–如果您正使用SYBR?Green染料以檢測(cè)雙鏈DNA,則選擇SYBR。c.從Quencher(淬火基團(tuán))下拉菜單中,選擇NFQ-MGB(默認(rèn))。探針得3′端,則選擇NFQ－MGB。–如果您正使用SYBRGreen染料,則選擇None(無(wú))。在Standards(標(biāo)準(zhǔn)品)屏幕上,為所有標(biāo)準(zhǔn)曲線輸入反應(yīng)板中得點(diǎn)數(shù)與1)單擊Howmanypointsdoyouneedforeachstandard建議每條標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)至少有五個(gè)稀釋點(diǎn)。Howmanyreplicatesdoyouneedforeachpoint？(每a。單擊EnterStartingQuantity(輸入起始量)字段,然后輸入應(yīng)仔細(xì)為您得檢測(cè)考慮標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量得適當(dāng)范圍:個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)之間。如果您為標(biāo)準(zhǔn)品指定大范圍得數(shù)量,您需使用PCR產(chǎn)物或高度濃縮得模板,如cDNA克隆。–如果您得cDNA模板數(shù)量有限且/或靶就是低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)錄物,或已知在給定范圍之內(nèi),則可能需要小范圍得標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量。5)Next＞(下一步)。設(shè)置。rgetassay?(每個(gè)靶檢測(cè)您需要多少陰性對(duì)照?),然后輸入3、opb、保留Color(顏色)字段中得默認(rèn)設(shè)置。mepopns–選擇AllSample/TargetReactions(所有樣本/靶反應(yīng))以檢測(cè)所–選擇SpecifySample/TargetReactions(指定樣本/靶反應(yīng))以指7)在WellCount(反應(yīng)孔數(shù))窗格中,確認(rèn)存在:8)在ViewPlateLayout(查瞧檢測(cè)板布局)選項(xiàng)卡上:a。從ArrangePlateby(反應(yīng)板布局方式)下拉菜單中,選擇Rowsb。從PlaceNegativeControls(放置陰性對(duì)照)下拉菜單中,選擇UpperLef(t左上角)(默認(rèn))、9)Next〉(下一步)、在RunMethod(運(yùn)行方法)屏幕上,查瞧默認(rèn)運(yùn)行方法得反應(yīng)體積與溫d2)單擊ReactionVolumePerWell(每個(gè)反應(yīng)孔得反應(yīng)體積)字段,然后輸入25μL。。如果實(shí)驗(yàn)需要一個(gè)不同得溫度變化過(guò)程設(shè)置,調(diào)整溫度變化過(guò)程設(shè)置或用?RunMethod(運(yùn)行方法)庫(kù)中得某個(gè)溫度變化過(guò)程設(shè)置進(jìn)行替換。RunMethod(運(yùn)行方法)庫(kù)包括在StepOne軟件中。在ReactionSetup(反應(yīng)設(shè)置)屏幕上,選擇檢測(cè)類型(如果使用TaqMan試劑),然后查瞧為準(zhǔn)備PCR反應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)稀釋序列與樣本稀釋而計(jì)。完成ReactionMixCalculations(反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算)選項(xiàng)卡1)選擇ReactionMixCalculations(反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算)選項(xiàng)卡(默認(rèn))。2)從SelectTarget(選擇靶)窗格中,選擇RNaseP。3)從AssayType(檢測(cè)類型)下拉菜單中,選擇Inventoried/MadetoOrder(庫(kù)存/定制)。ppliedBiosystemsTaqManGeneExpressionA如果正使用PrimerExpress?軟件設(shè)計(jì)檢測(cè),則選擇Custom0μL之間得反應(yīng)體積。包括額外反應(yīng)體積以彌補(bǔ)移液過(guò)程中得損失。建議至少準(zhǔn)備10％得額a、確認(rèn)MasterMixConcentration(母液濃度)字段中顯示2、0X。b、確認(rèn)AssayMixConcentration(檢測(cè)預(yù)混液濃度)字段中顯1)選擇SampleDilutionCalculations(樣本稀釋計(jì)算)選項(xiàng)卡、2)單擊DilutedSampleConcentration(10XforReactionMix)4)查瞧為樣本稀釋計(jì)算得劑量。msStore(AppliedBiosystems產(chǎn)品倉(cāng)庫(kù))、neNameRNaseP單擊FindAssay(查找檢測(cè)套件)、aDisplayAllItems,然后配合以下TaqMan?母液使用:TaqMan?FastUniversalPCRMasterMix(2?),NoAmpErase?TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,200次反應(yīng),編號(hào)TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase?TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase?UNG,2000次反應(yīng),編號(hào)10包裝TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,NoAm4)靶DNA或cDNA有幾種TaqMan與SYBRGreen試劑可用于定量實(shí)驗(yàn)、TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,200次反應(yīng),編號(hào)10包裝TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,編號(hào)TaqMan?2?UniversalPCRMasterMix,No,AmpErase?UNG,200次反應(yīng),編號(hào)seUNG編號(hào)TaqMan?PCRCoreReagentsKit,200次反應(yīng),編號(hào)N808-0228b。SYBR?Green試劑PowerSYBR?GreenPCRMasterMix(1mL),40次反應(yīng),編號(hào)PowerSYBR?GreenPCRMasterMix(5－mL),200次反應(yīng),編號(hào)PowerSYBR?GreenPCRMasterMix(10×5-mL),2000次反應(yīng),PowerSYBR?GreenPCRMasterMix(50mL),2000次反應(yīng),編號(hào)LSYBR?GreenPCRMasterMix(5—mL),200次反應(yīng),編號(hào)SYBR?GreenPCRMasterMix(50—mL),2000次反應(yīng),編號(hào)SYBR?GreenPCRCoreReagents,200次反應(yīng),編號(hào)9、完成設(shè)計(jì)向?qū)б瓿蒁esignWizard(設(shè)計(jì)向?qū)?工作流程,查瞧反應(yīng)板布局,然后1)在ReviewPlateforExperiment(查瞧實(shí)驗(yàn)得反應(yīng)板)窗口中,查2)單擊SaveExperiment(保存實(shí)驗(yàn))。Save(保存)以接受默Home頁(yè))屏幕。在將樣本添加到最終反應(yīng)預(yù)混液之前執(zhí)行樣本稀釋。采用StepOneTM軟件計(jì)算得劑量稀釋樣本。(樣本稀釋計(jì)算)根據(jù)儲(chǔ)液中得樣品濃度？ng/μL,Stepone軟件計(jì)算出稀釋劑量、因?yàn)樵贚計(jì)算”表稀釋樣本。微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機(jī)lation2等算)根據(jù)儲(chǔ)液中得標(biāo)準(zhǔn)品濃度？copies／μL,Stepone軟件計(jì)算出劑量。用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品得稀釋液(TE緩沖液或水)、標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)液微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機(jī)9)將標(biāo)準(zhǔn)品置于冰上,直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。若實(shí)驗(yàn)包括一個(gè)以上得靶檢測(cè),則為每個(gè)靶檢測(cè)單獨(dú)準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液頭、離心機(jī)2)為反應(yīng)預(yù)混液標(biāo)記一個(gè)適當(dāng)大小得反應(yīng)管:ReactionMix、3)將所需劑量得每種組分添加到反應(yīng)管中:母液(2、0X)12.5μL、檢測(cè)母注意:將檢測(cè)母液置于冰柜中避光儲(chǔ)存,直到準(zhǔn)備使用。過(guò)多暴露在光線下量。建議至少準(zhǔn)備10％得超額量。反應(yīng)管蓋。5)短暫地離心反應(yīng)管以除去氣泡。注意:使用之前,請(qǐng)執(zhí)行以下操作:,MicroAmpTMFastOptical48－WellReactionPlateMicroAmpTMOptical48-WellAdhesiveFilm(μL)x1水量(μL)3)對(duì)于每個(gè)重復(fù)組,準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液:反應(yīng)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品劑管反應(yīng)預(yù)劑量(μL)量(μL)1Std1Reactionm74、6Std18、3tdx3Std3Reactionmix74、6Std38、34Std4Reactionmi74、6Std48、3xPoPop28、34)對(duì)于每個(gè)重復(fù)組,準(zhǔn)備未知樣本得反應(yīng)預(yù)混液:劑量(μL)管Reactionmix(μL)反應(yīng)74、6b。5)用孔板高透光度蓋膜密封反應(yīng)板。線實(shí)驗(yàn)時(shí):。或–使用AdvancedSetup(高級(jí)設(shè)置)工作流程更改軟件中得反應(yīng)板布局、llReactionPlate裝載到StepOneTM擴(kuò)增儀以準(zhǔn)備運(yùn)行、a、打開擴(kuò)增儀抽屜b。將反應(yīng)載體放置在樣本加熱塊中、反應(yīng)板得方向取決于您所用耗材得類.若使用一個(gè)反應(yīng)板,讓A1反應(yīng)孔位于樣本加熱塊得左后角、2、啟動(dòng)運(yùn)行)2)單擊STARTRUN(啟動(dòng)運(yùn)行)。運(yùn)行期間,定期查瞧StepOne軟件提供得所有三條曲線就是否存在潛a。停止運(yùn)行在StepOne軟件中,單擊STOPRUN(停止運(yùn)行)。對(duì)話框中包括:–StopImmediately(立即停止)以立即停止運(yùn)行。–StopafterCurrentCycle/Hold(當(dāng)前循環(huán)/保持階段后停止)以在–Cancel(取消)以繼續(xù)運(yùn)行。t板布局)選項(xiàng)卡中所選反應(yīng)孔得數(shù)據(jù)。擴(kuò)增曲線將對(duì)照歸一化染料熒光(?Rn)AmplificationPlot(擴(kuò)增曲線)屏幕對(duì)識(shí)別與檢查異常擴(kuò)增十分有用。異常擴(kuò)增可能包括以下情況:強(qiáng)。?預(yù)期循環(huán)中不存在可檢測(cè)熒光(在相同情況下使用相同試劑從先前類似運(yùn)行期間,TemperaturePlot(溫度曲線)屏幕上實(shí)時(shí)顯示樣本加熱塊、受熱護(hù)蓋門與樣本(已計(jì)算)得溫度。t兩條曲線存在顯著偏差可能表示存在問(wèn)題、?HeatedCover(受熱護(hù)蓋門)曲線應(yīng)保持方法中指定得常溫。偏離一d、在RunMethod(運(yùn)行方法)屏幕上查瞧運(yùn)行進(jìn)度StepOneRunMethod(運(yùn)行方法)屏幕上顯得溫度變化過(guò)程報(bào)告運(yùn)行進(jìn)度。更改運(yùn)行方法(添加循環(huán)、保持或解鏈曲線)?在導(dǎo)航窗格中,單擊RunMethod(運(yùn)行方法)。?在RunMethod(運(yùn)行方法)屏幕上,執(zhí)行以下任意操作–若您想要將解鏈曲線階段添加到運(yùn)行得末尾,則選擇?AddMeltCurveStagetoEnd(將解鏈曲線階段添加到末尾)、?單擊SendtoInstrument(發(fā)送到擴(kuò)增儀)One當(dāng)StepOne擴(kuò)增儀顯示RunHistory(運(yùn)行歷史)屏幕時(shí),從St1)當(dāng)StepOne擴(kuò)增儀觸摸屏上顯示RunReport(運(yùn)行報(bào)告)屏幕時(shí)StepOneTM軟件使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)nts文件夾找到創(chuàng)建得試驗(yàn)設(shè)計(jì)打開實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)文件單擊Analyze(分析)a.ExperimentMenu(實(shí)驗(yàn)菜單)窗格－提供到以下軟件屏幕得鏈接:?Setup(設(shè)置)屏幕–AmplificationPlot(擴(kuò)增曲線)–StandardCurve(標(biāo)準(zhǔn)曲線)–RawDataPlot(原始數(shù)據(jù)曲線)QCSummary(QC摘要)MultiplePlotsView(多曲線視圖)cView局或反應(yīng)孔表要在分析屏幕上顯示特定反應(yīng)孔,在ViewPlateLayout(查瞧反應(yīng),操作如下:a、要選擇某特定類型得反應(yīng)孔,使用SelectWellsWith(選擇反應(yīng)孔類型)下拉菜單:選擇Sample(樣本)、Target(靶)或Task(任c、要選擇多個(gè)反應(yīng)孔,按住CTRL鍵并單擊、或按住Shift鍵并單擊反應(yīng)板布局中得某反應(yīng)孔并拖移鼠標(biāo)覆蓋所需得反應(yīng)孔。d。要選擇所有48個(gè)反應(yīng)孔,單擊反應(yīng)板布局得左上角。3)如何顯示多條曲線MultiplePlotsView(多曲線視圖)。b、要顯示四條曲線,單擊∷Showplotsina2×2matrix(以示曲線)。c.要在兩行中顯示兩條曲線,單擊∶Showplotsintworows(以2、查瞧標(biāo)準(zhǔn)曲線StandardCurve(標(biāo)準(zhǔn)曲線)屏幕顯示指定為標(biāo)準(zhǔn)品得樣本得標(biāo)準(zhǔn)曲線、StepOne軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知靶得數(shù)量。在StandardCurve(標(biāo)準(zhǔn)曲線)屏幕上檢查以下回歸系數(shù)值:斜率/擴(kuò)增效率值-擴(kuò)增效率通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)曲線中回歸線得斜率來(lái)計(jì)算。R–標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量范圍,為了獲得更準(zhǔn)確及更精確得效率測(cè)量值,使用大范圍得–標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)數(shù),為了獲得更準(zhǔn)確得效率測(cè)量值,包括重復(fù)數(shù)以降低移液R2值表示標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線與標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)得單個(gè)C數(shù)據(jù)點(diǎn)之間得擬合程T?CT值應(yīng)中靶得數(shù)?量太少;對(duì)于C值〉35得情況,期望更高得標(biāo)準(zhǔn)偏差。T1)從ExperimentMenu(實(shí)驗(yàn)菜單)窗格中,選擇Analysis(分析)?StandardCurve(標(biāo)準(zhǔn)曲線)。注意:如果StandardCurve(標(biāo)準(zhǔn)曲線)屏幕中未顯示數(shù)據(jù),單擊Analyze(分析)。2)在ViewPlateLayout(查瞧反應(yīng)板布局)選項(xiàng)卡上單擊反應(yīng)板布StandardCurve上顯示全部48個(gè)反應(yīng)孔、3)從Target(靶)下拉菜單中,選擇All(全部)。otlegend可接受范圍之內(nèi):示例實(shí)驗(yàn)中,所有樣本(藍(lán)點(diǎn))均在選擇:Rn循環(huán)變化－?Rn就是PCR運(yùn)行生成得歸一化熒光信號(hào)得T?Rn隨循環(huán)變化－Rn就是歸一化報(bào)告熒光染料。此曲線將Rn作為數(shù)。此曲線將閾值循環(huán)(CT)作為反應(yīng)孔位置得函數(shù)顯示。您可使用此曲線查②可在Ampli