SOD檢測波長的選擇及含量測定課件

實驗七SOD檢測波長的選擇及含量測定一、超氧化物歧化酶的基本特性

及生理功能1、超氧化物歧化酶的組成超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）是一種能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)的金屬酶，按金屬輔基不同分為三類：Cu,Zn-SODMn-SODFe-SOD

自由基：是一類非?；钴S的化學物質(zhì)，人體正常的新陳代謝就會產(chǎn)生自由基、是人體活動所需要的，但在某些特殊的情況下，體內(nèi)會產(chǎn)生過量的自由基。它可聚集體在人體各組織器官上，導致各種慢性病與老化，故說它是[萬病之源]，是人體健康的大敵。

2、超氧化物歧化酶的生理功能（1）延緩由于自由基侵害引起的衰老現(xiàn)象（2）治療由自由基損傷而誘發(fā)的疾病（3）消除肌肉疲勞（4）提高人體的抵抗力在選擇方法時應(yīng)考慮的幾點因素①實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測定所要花費的時間。考馬斯亮藍法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。一、紫外分光光度法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。

此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。

二、雙縮脲法（Biuret法）

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基（-CONH2）或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。

紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定波長為540nm，測定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。四、考馬斯亮蘭法（Bradford法）

1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

SOD檢測波長的選擇及含量測定實驗?zāi)康恼莆誗OD檢測波長的選擇方法學習考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量的原理。掌握考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量的實驗技術(shù)。

本實驗采用考馬斯亮藍G-250法測定SOD濃度。考馬斯亮藍G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色，它和蛋白質(zhì)通過范德華力（Vanderwals′bond）結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beer′slaw）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。實驗原理1.SOD檢測波長的確定準確稱取SOD粉末10mg，用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml蛋白溶液，作為標準儲備液Ⅰ。從上述儲備液Ⅰ中吸取兩份，每份0.4ml，分別放置在試管中，其中一份加入0.15mol/LNaCl溶液5ml，搖勻后備用；另一份中先加入0.15mol/LNaCl溶液0.6ml，再加入5ml考馬斯亮蘭試劑，1h內(nèi)以0.15mol/LNaCl溶液為空白分別進行全波長掃描，并記錄最大吸收波長。實驗步驟2.SOD標準曲線的制作

取已配制好的標準儲備液Ⅰ備用。取6支試管，按下表操作。試管編號0123451mg/mlSOD溶液/ml00.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl/ml1.00.80.70.60.50.4考馬斯亮蘭試劑/ml5ml搖勻，1h內(nèi)以0號試管為空白對照，在595nm處比色SOD標準曲線3.樣品測定精密吸取1mg/ml的SOD溶液0