酶的分離與純化優(yōu)秀課件

第四講酶的分離與純化講課：陽(yáng)飛系部：生化系C-312第四講酶的分離與純化教學(xué)目標(biāo)：了解酶純化方法的原理、步驟、特點(diǎn)以及策略理解酶分離純化的一般原則、酶分離和純化方法掌握細(xì)胞破碎的方法及酶分離純化的方法及原理教學(xué)重點(diǎn)：

細(xì)胞破碎的方法與特點(diǎn)、酶分離方法教學(xué)難點(diǎn)：

酶分離方法特點(diǎn)第四講酶的分離與純化4.1、酶的提取和分離純化4.2、酶的分離純化策略4.3、酶的分離純化與制備過(guò)程GoGoGo酶的分離純化一般程序：①預(yù)處理：材料的選擇、發(fā)酵液預(yù)處理、細(xì)胞破碎②粗分級(jí)分離：又稱初步純化或提取，采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒛康拿概c其他雜蛋白分離開(kāi)③細(xì)分級(jí)分離：又稱高度純化，即酶的精制④成品制作：使酶與溶劑分離。4.2、酶的分離純化策略①防止酶的變性失活②儲(chǔ)存及所有操作一般在低溫下（0～4℃）進(jìn)行③整個(gè)過(guò)程中反應(yīng)系統(tǒng)pH要適中（pH4～6）④操作中應(yīng)盡量避免激烈攪拌以減少泡沫形成1、基本原則2、分離純化策略1）目的明確2）建立一個(gè)可靠、快速的分析方法3）純化方法的選擇2）建立一個(gè)可靠、快速的分析方法①快速、可靠的分析目標(biāo)酶蛋白的方法②蛋白質(zhì)純度檢測(cè)方法③總蛋白量檢測(cè)方法④對(duì)必須清除的雜質(zhì)的分析方法3）純化方法的選擇純化過(guò)程不宜重復(fù)相同的步驟和條件減少添加劑的使用盡早去除有破壞性的雜質(zhì)盡早采用高效分離方法，將最昂貴最費(fèi)時(shí)的分離方法放在最后階段評(píng)價(jià)純化方法好壞標(biāo)準(zhǔn)：比活力提高倍數(shù)、總活力的回收率、重現(xiàn)性

酶純度檢驗(yàn)：電泳法、高效液相色譜法(HPLC)、化學(xué)結(jié)構(gòu)分析法、超離心沉降分析法、免疫學(xué)法、分光光度法4.3、酶的分離純化與制備過(guò)程1、材料的預(yù)處理2、細(xì)胞破碎（胞內(nèi)酶）3、酶的提取4、酶的分離純化方法及選擇5、酶的精制及方法6、酶制劑的類型2、細(xì)胞破碎（胞內(nèi)酶）指采用物理、化學(xué)或生物的方法使細(xì)胞壁或細(xì)胞膜破碎，從而使得細(xì)胞內(nèi)的酶得到釋放。細(xì)胞破碎的方法可分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩類。目前工業(yè)上最常用的是機(jī)械法。

JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)細(xì)胞破碎珠機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎★有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿★表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎★細(xì)胞破碎方法及其原理3、酶的提取指在一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過(guò)程,也稱為酶的抽提。首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說(shuō)來(lái)，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中；酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。一般酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過(guò)程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。討論：提高酶分子擴(kuò)散速度手段提高溫度降低溶液粘度增加擴(kuò)散面積縮短擴(kuò)散距離增大濃度差？4、酶的分離純化方法一、根據(jù)溶解度不同建立的純化方法二、按照分子大小不同建立的純化方法三、依據(jù)電學(xué)解離性質(zhì)不同建立的純化方法四、利用親和作用特性建立的純化方法五、利用穩(wěn)定性差異建立的純化方法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等點(diǎn)沉淀法有機(jī)聚合物沉淀法萃取分離凝膠過(guò)濾膜分離離子交換色譜電泳聚焦色譜親和色譜親和膜熱變性法酸堿變性法表面變性法★鹽析法大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象?！稃}析方法：Ks分段鹽析：在一定的溫度和pH值條件下（β為常數(shù)），通過(guò)改變離子強(qiáng)度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法β分段鹽析：在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（Ks為常數(shù)），通過(guò)改變溫度和pH值，使不同酶或蛋白質(zhì)分離的方法

在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等，其中以硫酸銨最為常用。溶解度大(25℃時(shí)達(dá)4.1mol／L)溶解溫度系數(shù)小(0℃為706g／L，25℃為767g／L)，即使是在低溫的溶解度范圍內(nèi)，幾乎所有的蛋白質(zhì)都能鹽析出來(lái)價(jià)格便宜濃度高時(shí)不易引起蛋白質(zhì)生物活性的喪失在鹽析時(shí)，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。飽和度指溶液中飽和硫酸銨體積與溶液總體積之比添加方法：1）添加飽和硫酸銨溶液2）加固體硫酸銨，固體硫酸銨的加入量可以查表★有機(jī)溶劑沉淀法原理：

利用酶在有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法常用的有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等★有機(jī)溶劑沉淀法要求：溶劑必須能與水完全混合，不與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)；溶劑蒸氣無(wú)毒且不易燃燒；溶劑用量一般為酶液體積的2倍左右，必須預(yù)先冷卻到-20℃左右在攪拌下緩慢加入；沉淀析出后盡快在低溫下（0℃以下）離心分離，用冷緩沖液溶解以降低有機(jī)溶劑的濃度；pH盡可能在靠近目標(biāo)酶的等電點(diǎn)?！镉袡C(jī)聚合物沉淀法原理：在酶液中加入某些高分子物質(zhì)，使其與酶形成聚合物而沉淀下來(lái)。離子型表面活性劑：十二烷基磺酸鈉(SDS)；非離子型聚合物：聚乙二醇(PEG)聚丙烯酸：因?yàn)榫郾┧嵘蠋в写罅康聂然?，沉淀帶正電的蛋白質(zhì)，兩者結(jié)合形成很大的顆粒而沉淀下來(lái)，加入鈣離子后，聚丙烯酸形成鈣鹽，使蛋白質(zhì)游離出來(lái)，從而使蛋白質(zhì)純化。★萃取分離原理：利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而分離。①雙水相萃取②超臨界流體萃取

③反膠團(tuán)萃?、匐p水相萃取原理：利用酶和雜蛋白等在不混溶的兩個(gè)水相系統(tǒng)中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離目。

優(yōu)點(diǎn)：①萃取過(guò)程條件溫和（兩相中含有70％以上的水），酶活力損失較少，處理量可大可?。虎谠O(shè)備簡(jiǎn)單，僅需一個(gè)儲(chǔ)罐和一個(gè)離心力不高的普通離心機(jī)；③操作方便、快捷，回收率一般可達(dá)80％～90％?！锔鞣N雙水相系統(tǒng)聚合物P聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉利用PEGl500／NaH2PO4體系三步雙水相萃取法回收率達(dá)96.3％，純化倍數(shù)為33

②超臨界流體萃取原理：將超臨界流體作為萃取溶劑，利用分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同分離。超臨界流體：指物質(zhì)狀態(tài)超過(guò)臨界點(diǎn)后的流體。物理特性和傳質(zhì)特性通常介于液體和氣體之間，黏度大大低于液體的黏度，接近氣體的黏度，有利于物質(zhì)擴(kuò)散；擴(kuò)散系數(shù)接近于氣體，是通常液體的近百倍，可迅速滲透到物體的內(nèi)部而溶解目標(biāo)物質(zhì)，快速達(dá)到萃取平衡。常見(jiàn)超臨界流體的超臨界點(diǎn)和超臨界密度流體名稱臨界溫度(℃)臨界壓力(Mpa)臨界密度（g/ml）乙烷C2H632.34.880.203丙烷C3H896.94.260.220丁烷C4H10152.03.800.228戊烷C5H12296.73.280.232乙烯C2H49.95.120.227氨NH3132.411.280.236二氧化碳CO231.17.380.46二氧化硫SO2157.67.880.525水H2O374.322.110.326笑氣N2O36.57.170.451氟里昂C28.83.900.578

★最常用超臨界流體為CO2臨界點(diǎn)的溫度為31.1℃，接近常溫臨界壓力較低，為7.38MPa無(wú)毒、操作較安全，且液體二氧化碳的擴(kuò)散系數(shù)大，可獲得高的傳遞速率溶劑容易從產(chǎn)品中分離出來(lái)③反膠團(tuán)萃取

反膠團(tuán)是兩性表面活性劑在非極性有機(jī)溶劑中親水基團(tuán)自發(fā)地向內(nèi)聚集而成的微小膠團(tuán)，反膠團(tuán)的形成使有機(jī)相內(nèi)形成了分散的親水微環(huán)境，使生物分子在有機(jī)相(萃取相)內(nèi)存在于反膠團(tuán)的親水微環(huán)境中，消除了蛋白質(zhì)難溶于有機(jī)相中或在有機(jī)相中發(fā)生不可逆變性的現(xiàn)象。表面活性劑類型：陰離子型、陽(yáng)離子型、非離子型。非極性有機(jī)溶劑：環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷。通過(guò)控制pH值、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑的種類以及表面活性劑的種類和濃度等條件，可以改變蛋白質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)，不同蛋白質(zhì)表面電荷與相對(duì)尺寸的不同使得它在兩相中的分配系數(shù)不同，從而達(dá)到分離的目的。特點(diǎn)：成本低、溶劑反復(fù)使用、萃取率和反萃取率高、防止酶失活★凝膠過(guò)濾（也稱凝膠色譜）原理：利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)根據(jù)分子大小進(jìn)行分離，通常以柱色譜的方式進(jìn)行，柱中填充的介質(zhì)是具有一定孔徑的球狀凝膠物質(zhì)，常用于生物大分子的分離。特點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便、不需要再生處理即可反復(fù)使用。★凝膠過(guò)濾介質(zhì)品種：葡聚糖系列、瓊脂糖系列、聚丙烯酰胺系列、Sephacryl系列、Sephadex系列、聚乙烯醇系列、Bio-BeadsS～X系列等。最常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠排列組成的鏈狀多糖等。柱色譜操作：色譜介質(zhì)的平衡、裝柱、加樣、擴(kuò)展(包括洗滌和洗脫)以及與此同時(shí)進(jìn)行的流出液成分(蛋白質(zhì)或酶活性)的檢測(cè)和收集?！锬し蛛x

原理：

利用微孔超濾膜選擇性地透過(guò)一定大小的分子而達(dá)到分離目的。分類：②根據(jù)膜分離過(guò)程推動(dòng)力本質(zhì)分類：③按材料分：天然高分子材料膜、有機(jī)(合成)高分子聚合物膜、無(wú)機(jī)多孔材料膜④按膜結(jié)構(gòu)：對(duì)稱性膜、不對(duì)稱膜、復(fù)合膜①按膜孔徑大小進(jìn)行分類：★超濾技術(shù)超濾技術(shù)是近年來(lái)依托于材料科學(xué)發(fā)展起來(lái)的先進(jìn)的膜分離技術(shù)，超濾分離精度介于納濾與微濾之間。超濾膜通常使用的材料都是高分子聚合物，如聚砜類、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、醋酸纖維素等。通常超濾膜所標(biāo)稱的截留分子質(zhì)量，對(duì)具有相同分子質(zhì)量的線形分子和球形蛋白質(zhì)類分子，物質(zhì)的截留率分別應(yīng)≥90％和≥95％。目前常用超濾膜的截留分子質(zhì)量范圍在1～1000kDa之間。工業(yè)上常用超濾膜器件

膜組件比表面積（m2/m3）設(shè)備費(fèi)用操作費(fèi)膜面吸附層的控制應(yīng)用管式20～30極高高很容易UF、MF平板式400～600高低容易UF、MF螺旋卷式800～1000低低難UF、MF、RO毛細(xì)管式600～1200低低容易UF、MF、中空纖維式10000很低低很難UF、RO★離子交換色譜原理：利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對(duì)各種離子的作用力不同而達(dá)到分離目的。通常是在固定相和流動(dòng)相之間發(fā)生的可逆的離子交換反應(yīng)。離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)，通過(guò)在不溶性高分子物質(zhì)(母體)引入可解離的基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成的，這些基團(tuán)在水溶液中可與其它陽(yáng)離子或陰離子起交換作用。按照離子交換劑的不同又可分為陽(yáng)離子交換劑(cationexchanger)和陰離子交換劑(anionexchanger。解離基團(tuán)為強(qiáng)電離基團(tuán)的稱為強(qiáng)離子交換劑，碘酸基是強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑。而帶有弱解離基團(tuán)的稱為弱離子交換劑，如羧甲基是弱酸性陽(yáng)離子交換劑。離子交換色譜操作過(guò)程：預(yù)處理加樣吸附洗滌洗脫★電泳

原理：利用它們?cè)陔妶?chǎng)中的遷移方向與遷移速度的不同而進(jìn)行純化。分類：(1)聚丙烯酰胺凝膠電泳(2)等電聚焦電泳(3)連續(xù)凝膠電泳(4)連續(xù)流動(dòng)電泳(5)無(wú)載體連續(xù)流動(dòng)電泳(1)聚丙烯酰胺凝膠電泳：

(polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE)以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)，由單體丙烯酰胺(acrylamide)和亞甲基雙丙烯酰胺(N，N’-methylenebisacrylamide)聚合而成的。PAGE是蛋白質(zhì)研究中最常用的電泳方法，常用的聚丙烯酰胺凝膠電泳是垂直平板電泳，以不連續(xù)方式進(jìn)行，即電泳的膠與緩沖體系都具有不連續(xù)性。特點(diǎn)：濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、高分辨率SDS主要用于蛋白質(zhì)的純度分析和分子量測(cè)定。(2)等電聚焦電泳：利用蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)具有等電點(diǎn)，在等電點(diǎn)pH值下呈電中性，從而不發(fā)生泳動(dòng)特點(diǎn)而進(jìn)行的電泳分離。在電泳設(shè)備中首先需調(diào)配連續(xù)的pH梯度，然后使蛋白質(zhì)在電場(chǎng)作用下泳動(dòng)到與各自等電點(diǎn)相等的pH值區(qū)域而不再繼續(xù)泳動(dòng)，形成具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)區(qū)帶。調(diào)配穩(wěn)定的連續(xù)pH梯度一般采用氨基酸混合物或氨基酸聚合羧酸的緩沖液。如已經(jīng)商業(yè)化載體Ampholine為數(shù)百種組分的混合物，各組分具有不同等電點(diǎn)，一般有pH4～6、pH8～10、pH9～113種pH梯度范圍供選擇。(3)連續(xù)凝膠電泳：連續(xù)凝膠電泳實(shí)質(zhì)上是聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了在批次內(nèi)連續(xù)將各個(gè)電泳區(qū)帶分離回收，并可進(jìn)行多批次分離操作。在電場(chǎng)作用下，電泳形成的區(qū)帶依次連續(xù)走出凝膠并進(jìn)行洗脫、收集，達(dá)到將各組分分離回收的目的；(4)連續(xù)流動(dòng)電泳：最早使用的連續(xù)流動(dòng)電泳是在紙電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。以濾紙為載體，可以減少分離組分在流動(dòng)的緩沖液中的自由擴(kuò)散。將濾紙的上端插入電泳液槽中，依靠毛細(xì)管虹吸作用和重力作用，電泳液沿著紙面向下均勻流動(dòng)，在垂直于電泳緩沖液流動(dòng)方向施加電場(chǎng)，即在濾紙的兩個(gè)側(cè)邊上與電極接觸，將欲分離的樣品以定點(diǎn)方式流加在濾紙上，加樣點(diǎn)的位置需根據(jù)各組分的電泳行為確定。在電場(chǎng)作用下帶有不同電荷的組分隨著電泳緩沖液向前流動(dòng)的同時(shí)而向不同的電極方向遷移。(5)無(wú)載體連續(xù)流動(dòng)電泳：又稱為連續(xù)自由流動(dòng)電泳，實(shí)質(zhì)上與連續(xù)流動(dòng)載體電泳類似，只是不使用載體，而使用兩張塑料板，在它們之間形成0.5～0.8mm的間隙作為電泳槽，使電泳緩沖液從下到上平行流過(guò)電泳槽，依靠表面張力減少液體內(nèi)部的流動(dòng)性，待分離樣品從下端某一點(diǎn)連續(xù)加入，在垂直于電泳緩沖液流動(dòng)方向上的電場(chǎng)作用下，帶有不同電荷的各個(gè)組分分別向不同的電極方向遷移，在電泳槽的末端，將流出的電泳緩沖液分割，再分別檢測(cè)、收集，即可獲得分離的各個(gè)組分。多孔膜自由流動(dòng)電泳示意圖利用多孔膜將電泳槽分離成多個(gè)小池，在電場(chǎng)作用下，電泳分離的物質(zhì)可透過(guò)膜在小池之間遷移，在各小池流動(dòng)的電泳緩沖液不僅可起到帶走電泳產(chǎn)生的熱量的作用，同時(shí)也可收集電泳產(chǎn)生的不同區(qū)帶，從而達(dá)到分離的目的。聚焦色譜原理：當(dāng)用特種的緩沖液滴定和淋洗填裝在色譜柱中的特種多緩沖交換劑時(shí)，隨著這種緩沖液的擴(kuò)展，會(huì)在色譜柱中自上而下地建立起連續(xù)的pH梯度，將待純化樣品加入該色譜柱，其中的蛋白質(zhì)組分就將隨著多緩沖液的擴(kuò)展按各自的等電點(diǎn)聚焦于相應(yīng)的pH值區(qū)段并隨擴(kuò)展過(guò)程中pH梯度的逐漸下降，最后分別從色譜柱先后流出，從而達(dá)到分離純化的目的。兼有等電聚焦電泳的高分辨率和柱色譜簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)★親和色譜原理：與酶發(fā)生結(jié)合的配基通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)固定于色譜柱料載體上，當(dāng)樣品流過(guò)色譜柱時(shí)，目標(biāo)酶即迅速吸附于其上，而雜蛋白則在此過(guò)程中隨緩沖液流出，而后可以通過(guò)在洗脫液中加入親和力更強(qiáng)的配基，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用使酶與配基解離，也可通過(guò)改變條件促進(jìn)色譜系統(tǒng)的解吸，選擇性地將酶從親和吸附柱上分離下來(lái)。酶與底物、酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、酶與輔助因子、抗原與抗體、酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段、RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段等之間，都是具專一而又可逆親和力的生物分子對(duì)。親和色譜原理及過(guò)程★選擇性熱變性法即在嚴(yán)格控制的條件下，將酶溶液迅速升溫到某一溫度并保溫一定時(shí)間(通過(guò)試驗(yàn)確定)，而后迅速冷卻，這樣大量不耐熱的雜蛋白就將變性析出，通過(guò)離心可除去，而酶的總活力損失很少，同時(shí)比活力大大上升。在酶溶液進(jìn)行熱處理前加入該酶的底物、輔酶、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、保護(hù)巰基的還原劑等，以增大酶和雜蛋白問(wèn)的耐熱性差別。嚴(yán)格控制溶液的pH值，因?yàn)椴煌琾H值條件下酶的熱穩(wěn)定性是有差別的，只有在一定的pH值條件下，才可能使操作具有較好的重現(xiàn)性，尤其是在樣品溶液有蛋白酶污染的情況下，應(yīng)用此法時(shí)應(yīng)特別謹(jǐn)慎。胰蛋白酶、胰核糖核酸酶、溶菌酶★選擇性酸堿變性法如果在一定溫度下，目標(biāo)酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸性或耐堿性，而這一條件對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的，那么可以將溶液的pH值嚴(yán)格控制在一定范圍內(nèi)并處理一定時(shí)間，同樣可達(dá)到一定的純化效果。與選擇性熱變性相比，酸堿變性應(yīng)用得不多，主要原因可能在于操作較為復(fù)雜，條件不易控制，而且純化效果較差?！锉砻孀冃苑ɡ妹溉芤汉投栊砸后w(三氯甲烷)混合振蕩，造成選擇性表面變性，振蕩處理后混合液通常分為三層：上層為未變性蛋白質(zhì)，中間層為乳濁狀變性蛋白質(zhì)．下層為三氯甲烷。利用泡沫形成也可達(dá)到選擇性表面變性的目的。應(yīng)用表面變性法時(shí)需控制的因素很多，除了泡沫大小以及泡沫形成的速度外，pH值和溫度也十分重要。和酸堿變性一樣，它的應(yīng)用面遠(yuǎn)不如選擇性熱變性。過(guò)氧化氫酶、醇脫氫酶和α-淀粉酶通氯氣到磷酸核糖變位酶和核苷磷酸化酶的溶液中，可使磷酸核糖變位酶表面變性而純化核苷磷酸化酶。5、酶的精制一、酶的濃縮二、酶的結(jié)晶三、酶的干燥一、酶的濃縮濃縮是從低濃度酶液中除去部分的水或其他溶劑而使之成為高濃度溶液的過(guò)程。抽提液(或發(fā)酵液)中酶濃度一般都很低，所以在進(jìn)行純化前往往須先予以濃縮，通過(guò)濃縮可以提高濃度、縮小體積，同時(shí)酶和蛋白質(zhì)在濃縮溶液中的穩(wěn)定性也較高。常用的濃縮方法：蒸發(fā)、超濾、凝膠過(guò)濾、沉淀法、滲透二、酶的結(jié)晶結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過(guò)程。酶在結(jié)晶之前必須經(jīng)過(guò)純化達(dá)到一定的純度，通常酶的純度應(yīng)當(dāng)在50％以上才能