細胞死亡判定-講課用第四節(jié)

細胞死亡判定提綱細胞死亡判定意義細胞死亡定義及判定方法細胞死亡判定方法中存在的問題細胞死亡判定方法使用—兼談人體死亡判定一細胞死亡判定意義發(fā)酵抗癌藥物篩選二細胞死亡定義及判定方法平板計數(shù)法1.繁殖力克隆形成實驗clonogenicassayMPNmostprobablenumber2.1細胞膜完整性顯微鏡觀察？電子顯微鏡？染料類別膜通透性染料非膜通透性染料常見膜完整性檢測用染料傳統(tǒng)可見染料：甲基藍、Evan’sBlue、NeutralRed傳統(tǒng)可見染料的不足熒光染料：PI、SYTOX、SYBREB&FDA流式細胞儀的優(yōu)點準確快速：一般分選速度＞1000個/秒

大量多參數(shù)同時分析（形狀，尺寸大小，熒光顏色及強度）Lymphocytes:淋巴細胞Monocytes：單核細胞Granulocytes：粒細胞PI&AnnexinV-FITC分析細胞凋亡問：凋亡細胞是活細胞還是死細胞？2.2細胞膜電位ATP測定方法ATPADP熒光素加氧熒光素熒光素酶活細胞比率處理組含量對照組含量=100%ATP法特點敏感性高：可檢測最少20個細胞適用范圍較廣：可對實體瘤、胸腹水、血液等多種腫瘤標本進行體外藥敏檢測時間短：30-60分鐘內(nèi)Tetrazolium家族四氮唑化合物3.2氧化還原脫氫酶MTS還原產(chǎn)物具溶解性3.3

pH梯度檢測染料carboxyfluorescein(cF),BCECF,pyraninecSNARF-1pHandHealth熒光素二乙酯（FluoresceinDiacetate，F(xiàn)DA）4.酯酶5.分子生物學技術(shù)DNA等分子在死亡細胞中比活細胞中更快降解長序列監(jiān)測技術(shù)比短序列監(jiān)測更能反映生命力檢測對象DNArRNAmRNA檢測方法：DNAprobe檢測方法：PCRPCR擴增方法RT-PCRNASBA(nucleicacidsequence-basedamplification,依賴性核酸序列的擴增)RT-SDA(reversetranscriptase-stranddisplacementAmplification,鏈替代擴增)細胞死亡判定方法總結(jié)Keer&Birch,2003三細胞死亡判定方法中存在的問題現(xiàn)有方法存在的相關(guān)問題1膜完整性測試：染上顏色的細胞一定是死亡細胞？MTT,FDA：沒有染上顏色的細胞一定是死細胞？膜完整性測試活性染料陰性細胞能否再存活？Caronetal.,1998問題2：活性染料越深生命力越強？Resveratrol白藜蘆醇蒽醌萜類化合物蓼科植物虎杖白藜蘆醇的功效天然的抗氧化劑葡萄酒中的抗癌明星法蘭西奇跡具有神奇抗癌效能的白藜蘆醇白藜蘆醇的抗白血病作用白藜蘆醇處理細胞MTT還原活性白藜蘆醇處理細胞MTT還原活性生長抑制細胞MTT還原活性上升原因探討B(tài)reeuweretal.,1994.AEM.60(5)1467-1472Jochem,1999.MarineBiology.135:721-728酯酶活性的存在

2.完整的細胞膜問題3：FDA染色中存在的問題0C0C30C■DES▲DCCD●noneEnergy-dependent,Carrier-Mediatedextrusion▲TPP●none緩沖液等對熒光強度的影響培養(yǎng)基組成對熒光強度的影響熒光影響因子四細胞死亡判定方法使用—兼談人體死亡判定以后的科研工作中該如何使用？心肺死亡概念腦死亡判定全腦死亡：循環(huán)和呼吸功能的不可逆終止，或包括腦干在內(nèi)的全腦功能不可逆終止腦干死亡：為意識和認知功能的喪失是腦干上行網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，必將導致患者全腦功能的喪失而死亡。高級腦死亡：把意識功能的喪失作為診斷的關(guān)鍵腦死亡男子器官即將移植時蘇醒Fourmonthsafterhewasdeclaredbraindeadanddoctorswereabouttoremovehisorgansfortransplant,ZachDunlapis