植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一

培養(yǎng)基貯備液（母液）的配制目的與要求：熟悉MS培養(yǎng)基的組成，掌握貯備液的配制方法.實(shí)驗(yàn)步驟：稱量分別溶解混合定容。一，MS培養(yǎng)基的組成1、大量成分→貯備液Img/LNH4NO3 1650KNO3 1900CaCl22H2O 440MgSO47H2O 370KH2PO4 170

配制20倍濃度貯備液500mL.3、鐵→貯備液IIImg/L FeSO47H2O 27.8 Na2EDTA2H2O 37.3

4、有機(jī)成分→貯備液IVmg/L

肌醇 100

煙酸 0.5

鹽酸硫胺素(VB1) 0.1

鹽酸吡哆醇 0.5

甘氨酸 2

配制100倍濃度貯備液100mL.配制100倍濃度貯備液100mL.二，常用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA：1mg/mL(溶于少量1N鹽酸后以蒸餾水定容）。NAA:1mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸餾水定容）。三、作業(yè)：（一）

一般可將MS培養(yǎng)基分為哪四個(gè)部分？分別含有幾種試劑？各種試劑的濃度（mg/L）如何？（二）

如需配制MS培養(yǎng)基的20×的貯備液I量為500mL、100×的貯備液II、III和IV各100mL以及BA和NAA（濃度為1mg/mL）各50mL，則應(yīng)分別稱取多少量的各種試劑？注意要點(diǎn)有哪些？實(shí)驗(yàn)二固體培養(yǎng)基的配制與滅菌

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)、掌握植物組織固體培養(yǎng)基的配制和滅菌方法。

二、實(shí)驗(yàn)步驟：稱量混合調(diào)pH值滅菌稱量：按每瓶培養(yǎng)基終體積50mL計(jì)，稱取適量的瓊脂（常用量8g/L）和蔗糖（常用量30g/L），置于大燒杯中，加蒸餾水至需配培養(yǎng)基終體積的3/4左右，（加熱）使之溶解。

混合：分別加入一定量的貯備液I、II、III、IV和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及其它特殊補(bǔ)加物，再加蒸餾水直至需配培養(yǎng)基的終體積。調(diào)pH值：充分混合后，在60℃水浴條件下用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至5.8。

滅菌：封嚴(yán)培養(yǎng)容器口后，120℃滅菌20min后，將培養(yǎng)基取出，置于水平臺(tái)子上，在室溫下冷卻，備用。實(shí)驗(yàn)三外植體材料的預(yù)處理、

消毒及接種一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

熟悉外植體材料的預(yù)處理，掌握其消毒和接種方法。

（二）用洗衣粉水（1~2角匙洗衣粉/100ml水）等浸洗上述植物材料約5min，再用自來(lái)水沖凈洗衣粉水。這是進(jìn)一步減少污染的處理。同時(shí)配制消毒液：50%次氯酸鈉溶液。（三）

將接種用具、無(wú)菌水等從80℃烘箱中或直接從高壓滅菌器中取出，置于超凈工作臺(tái)上。打開(kāi)超凈工作臺(tái)中的紫外燈，在進(jìn)行紫外線滅菌處理至少30min后關(guān)掉紫外燈。（四）

操作人員洗手擦干，換上潔凈工作服，戴上帽子以免頭發(fā)散落以及帶來(lái)污染。坐到超凈臺(tái)前，并將裝有經(jīng)濕熱滅菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶、配好的消毒液、洗凈瀝干的植物材料置于超凈工作臺(tái)上，用70%酒精棉球擦手與器具外壁，即可對(duì)經(jīng)上述預(yù)處理的植物材料進(jìn)行表面滅菌處理，自此以后各步均須在超凈工作臺(tái)上操作。（六）在持續(xù)滅菌時(shí)間內(nèi)定時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)植物材料各部分與消毒液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使滅菌徹底。在滅菌時(shí)間結(jié)束前1min時(shí)，即可開(kāi)始用玻璃棒等輕輕壓住植物材料將消毒液慢慢倒入廢物缸，注意勿使植物材料滑出。接著立即倒入適量無(wú)菌水，輕攪植物材料以清洗去除滅菌劑殘留。一般表面滅菌時(shí)間的計(jì)算是從倒入消毒液開(kāi)始，到倒入無(wú)菌水為止。無(wú)菌水的清洗時(shí)間每次約3min；清洗5次。

（七）倒出、瀝去最后一次清洗用水，開(kāi)始進(jìn)行植物材料的切割及接種。逐一取出經(jīng)上述滅菌處理的植物材料，置于下面墊有經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)皿（或小白瓷碟）的無(wú)菌紗布或?yàn)V紙上，左手拿小鑷子，右手拿解剖刀，切除各切段或切塊上被滅菌劑毒壞的部分。如有必要，也可再行切分。在完成切割后，將解剖刀和小鑷子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精燈焰上灼燒滅菌之后放回原處，以便待冷卻后下一切割再用。

（八）接著，左手拿培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)容器口外壁在靠近酒精燈外焰處轉(zhuǎn)燎數(shù)秒，以將其可能帶有的微生物等固定于原處；在酒精燈焰附近處，用右手拇指與食指配合將瓶塞打開(kāi)，并將其夾于左手無(wú)名指與最小指之間；再將培養(yǎng)瓶口在酒精燈焰上輕轉(zhuǎn)灼燒滅菌；以右手拇指與食指配合，用大鑷子夾緊一外植體準(zhǔn)確送入培養(yǎng)容器，并將其輕輕地半插入固體培養(yǎng)基；將大鑷子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精燈焰上灼燒滅菌之后放回原處，以便待冷卻后下一操作再用；將培養(yǎng)瓶口及瓶塞分別在酒精燈焰上小心地輕轉(zhuǎn)灼燎數(shù)秒；蓋好瓶塞，旋緊，將其置于超凈工作臺(tái)的適當(dāng)位置。

三、作業(yè)：

練習(xí)無(wú)菌操作；統(tǒng)計(jì)植物材料表面滅菌結(jié)果；分析污染原因；提出減少或避免污染的措施。

實(shí)驗(yàn)四枝芽增殖培養(yǎng)基的

設(shè)計(jì)與配制

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)、掌握枝芽增殖培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)、配制方法。

二、方法步驟：

（一）稱取4g瓊脂和15g蔗糖，加蒸餾水至需配培養(yǎng)基終體積500mL的3/4，加熱使之溶解，并在80℃熱水浴中保溫。（二）分別加入一定量的MS培養(yǎng)基貯備液I、II、III和IV及NAA0.25mg，然后1~5各小組再分別加入各自不同量的BA（0.25；0.5；0.75；1及1.5mg）。（三）充分混勻后，用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至5.8。定容至500mL。（四）將培養(yǎng)基分裝到所選用的培養(yǎng)容器中，每個(gè)容器的裝量不超過(guò)其最大容量的1/3。擰緊瓶蓋。（五）將裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器置高壓滅菌器中高壓滅菌（120℃，20min）。滅菌結(jié)束后從高壓滅菌器中取出，置于平臺(tái)上冷卻，備用。

實(shí)驗(yàn)五枝芽增殖培養(yǎng)的外植體的處理與接種

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)、掌握枝芽增殖培養(yǎng)外植體的處理、接種方法。

二、方法步驟：

（一）將經(jīng)濕熱滅菌裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器、接種用具等置于超凈臺(tái)上，打開(kāi)超凈臺(tái)的紫外燈，滅菌處理30min。（二）操作人員坐到超凈臺(tái)前，用浸有70%酒精的棉球擦超凈臺(tái)面、操作者手等部分。（三）點(diǎn)燃酒精燈，從裝有無(wú)菌苗的培養(yǎng)瓶中取出無(wú)菌苗，置于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中的無(wú)菌濾紙上，用滅過(guò)菌的刀和鑷子配合操作，從葉柄處切下，將所有葉片去除，只留下近莖部的一小段葉柄。（四）將去除葉片后的莖，切分成帶腋芽的莖段。(五）打開(kāi)培養(yǎng)容器蓋子，將莖段按其自然極性方向垂直插入培養(yǎng)基，蓋好培養(yǎng)容器蓋子，置于超凈臺(tái)上適當(dāng)位置。對(duì)接種用具、超凈臺(tái)面、操作者手等進(jìn)行適當(dāng)滅菌處理，繼續(xù)接種。如此操作，直至完成。

二、方法步驟：（一）稱取4g瓊脂和15g蔗糖，加蒸餾水至需配培養(yǎng)基終體積500mL的3/4，加熱使之溶解，并在80℃熱水浴中保溫。（二）分別加入一定量的MS培養(yǎng)基貯備液I、II、III和IV，然后1~5各小組再分別加入各自不同量的NAA（0.25；0.5；0.75；1及1.5mg）。（三）充分混勻后，用0.1